Firmas de microbioma intestinal de adaptación al medio ambiente extremo en cerdo tibetano

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 27 (2023) Citar este artículo

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Los cerdos tibetanos (TP) pueden adaptarse a los entornos extremos de la meseta tibetana implicados por las señales de su propio genoma, pero se sabe poco sobre las funciones de la microbiota intestinal en la adaptación del huésped. Aquí, reconstruimos 8210 genomas ensamblados en metagenoma de TP (n = 65) que vivían en cerdos cautivos de gran y baja altitud (87 de China: CP y 200 de Europa: EP) que se agruparon en 1050 contenedores de genoma a nivel de especie. (SGB) en el umbral del 95% de identidad de nucleótidos promedio. El 73,47% de los SGB representaron especies nuevas. El análisis de la estructura de la comunidad microbiana intestinal basado en 1048 SGB mostró que los TP eran significativamente diferentes de los cerdos cautivos de baja altitud. Los SGB asociados a TP permitieron digerir múltiples polisacáridos complejos, incluidos celulosa, hemicelulosa, quitina y pectina. En especial, encontramos que los TP mostraron el enriquecimiento más común de phyla Fibrobacterota y Elusimicrobia, que estaban involucrados en la producción de ácidos grasos de cadena corta y media (ácido acético, butanoato y propanoato; ácidos octanómico, decanoico y dodecanoico), así como en la biosíntesis de lactato, 20 aminoácidos esenciales, múltiples vitaminas B (B1, B2, B3, B5, B7 y B9) y cofactores. Inesperadamente, Fibrobacterota solo mostró una poderosa capacidad metabólica, incluida la síntesis de ácido acético, alanina, histidina, arginina, triptófano, serina, treonina, valina, B2, B5, B9, hemo y tetrahidrofolato. Estos metabolitos podrían contribuir a la adaptación del huésped a la gran altitud, como la recolección de energía y la resistencia contra la hipoxia y la radiación ultravioleta. Este estudio proporciona información sobre la comprensión del papel que desempeña el microbioma intestinal en la adaptación de los mamíferos a grandes altitudes y descubre algunos microbios potenciales como probióticos para mejorar la salud animal.

El cerdo tibetano (Sus scrofa domesticus) es una raza autóctona originaria de la meseta de Qinghai-Tíbet que puede sobrevivir a largo plazo en ambientes hostiles a gran altitud, como hipoxia, frialdad intensa, radiación ultravioleta intensa (UVR) y escasez de alimentos1, 2,3. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo de adaptación a gran altitud del cerdo tibetano es muy importante para el descubrimiento de nuevos componentes genéticos implicados en la resistencia al estrés. El análisis genómico ha descubierto 268 genes bajo selección positiva en jabalíes tibetanos que están relacionados con adaptaciones a la gran altitud, como el mantenimiento de la estabilidad genómica frente a la RUV y la adaptación molecular bajo hipoxia4. Más específicamente, este estudio identificó tres genes de unión a la vitamina B6 (ALB, SPTLC2 y GLDC) que ayudan en la síntesis de hemoglobina y mejoran la unión de oxígeno y cuatro genes relacionados con la hipoxia (ALB, ECE1, GNG2 y PIK3C2G). Un estudio adicional encontró mutaciones genéticas en los genes PLA2G12A y EPAS1 relacionadas con la variación fenotípica del tono vascular pulmonar y la concentración de hemoglobina5. Recientemente, estudios adicionales también prestaron atención a las firmas del microbioma intestinal de la adaptación a la gran altitud en el cerdo tibetano, debido al papel esencial que desempeña la microbiota intestinal en el metabolismo nutricional6,7, la regulación energética8,9 y el desarrollo del sistema inmunitario para mantener la salud del huésped10,11. Por ejemplo, un metanálisis ribosómico 16 S reveló las tres bacterias intestinales más abundantes Acinetobacter, Pseudomonas y Sphingobacterium en el cerdo tibetano en comparación con el cerdo de baja altitud12. El análisis metabolómico de 12 muestras fecales de cerdos tibetanos de gran altitud demostró que las producciones de ácido propanoico y ácido octadecanoico mejoraron significativamente y que los genes relacionados con estos dos metabolitos también aumentaron12. En resumen, estos hallazgos indicaron que los entornos de gran altitud dieron forma al microbioma intestinal único y a la diversidad funcional del cerdo tibetano. Sin embargo, sigue sin estar claro acerca de la diversidad y el paisaje funcional en la microbiota intestinal en el cerdo tibetano y su firma para la adaptación del huésped a gran altitud, debido a las limitaciones del pequeño tamaño de la muestra y la baja profundidad de secuenciación metagenómica en los estudios anteriores.

Los cerdos son los principales animales domésticos en todo el mundo que sirven como un componente importante de la producción ganadera mundial. Sin embargo, el rápido crecimiento de la producción ganadera en las últimas décadas también ha llevado a la aparición y propagación de enfermedades infecciosas, como el virus de la diarrea epidémica porcina, y trae directamente enormes pérdidas económicas a la industria porcina13,14. Impulsa las aplicaciones más comunes de la administración de antibióticos en la producción porcina para el tratamiento y la prevención de infecciones en los períodos de lactancia y posdestete. El uso de antibióticos contribuye al aumento de la resistencia microbiana y a la disminución de la diversidad microbiana15,16, así mismo, puede representar un riesgo para la salud de los cerdos. Para reducir el efecto secundario del uso de antibióticos, Blaser17 recomendó probióticos para reemplazar especies y cepas vitales desaparecidas o extintas que modulaban vías de desarrollo cruciales, tal vez con prebióticos acompañantes. Los parientes silvestres o las razas nativas de animales domésticos podrían representar un gran recurso para la exploración de probióticos. Por ejemplo, Rosshart et al.18 informaron que el eventual injerto de microbioma intestinal de ratón salvaje en ratones de laboratorio podría promover la aptitud del huésped y mejorar la resistencia a la enfermedad de la infección pulmonar y la tumorigénesis. La transferencia de microbios fecales de una raza de cerdo autóctona que tenía una mayor resistencia a las enfermedades a los lechones comerciales podría prevenir la diarrea recurrente inducida por el estrés del destete temprano19. Recientemente, se identificaron más de 13 000 genes degradadores de carbohidratos en el microbioma intestinal del cerdo tibetano (n=11), que se distribuyeron principalmente en cinco filos: Firmicutes, Bacteroidetes, Spirochaetota, Verrucomicrobiota y Fibrobacterota20. Estos estudios indicaron que el cerdo tibetano podría albergar microbios probióticos inesperados para mejorar la salud de los cerdos. Sin embargo, hasta ahora, todavía falta una investigación sistémica a nivel del genoma sobre el microbioma intestinal del cerdo tibetano.

Aquí, realizamos una secuenciación metagenómica profunda de 31 muestras de heces y 34 de contenido ciego de 47 cerdos tibetanos (TP) que pastan libremente ubicados en la prefectura de Deqen de la provincia de Yunnan en China, con una elevación promedio de más de 3500 m sobre el nivel del mar. Recuperamos 1048 contenedores de genoma a nivel de especie (SGB) del microbioma intestinal de cerdo mediante la integración de metagenomas intestinales publicados de 287 cerdos cautivos de baja altitud (87 de China -CP y 200 de Europa -EP). Descubrimos una diversidad distinta y perfiles funcionales de la microbiota intestinal en los TP en comparación con los CP y los EP. Los resultados no solo proporcionarán información para comprender la adaptación a gran altitud de los cerdos tibetanos, sino que también explorarán el potencial de la microbiota intestinal asociada a TP como probióticos.

La plataforma Illumina HiSeq × Ten generó más de 779 Gb de datos de secuencias metagenómicas a partir de muestras de 65 TP (Tabla complementaria 1). Integramos las lecturas sin procesar de secuenciación anteriores con un conjunto de datos de secuencia metagenómica publicado de 287 cerdos cautivos de Dinamarca, Francia y China21 para generar el catálogo del genoma intestinal de los cerdos. Utilizando una estrategia de ensamblaje de muestra única, reconstruimos un total de 8210 MAG con un umbral de calidad de integridad >75 % y contaminación <10 %22,23 (ver "Métodos"; Fig. 1A). En total, 3807 de estos MAG eran genomas de alta calidad con > 90 % de integridad con < 5 % de contaminación (Fig. 1B). Después de la desreplicación a un umbral de identidad de nucleótidos promedio (ANI) del 95 %24, se identificaron 1050 SGB para análisis adicionales (consulte "Métodos"). Utilizamos al menos un 40 % de cobertura genómica para determinar la presencia de SGB en cada muestra, y finalmente se obtuvieron 1048 SGB representativos, de los cuales 623 SGB (59,45 %) eran genomas de alta calidad (>90 % de integridad y <5 % de contaminación) (Cuadro complementario 2). Cada SGB estaba respaldado por un promedio de 7,8 MAG y el 57,25% de los SGB contenían al menos dos MAG (Tabla complementaria 2). Utilizamos el conjunto de herramientas de la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB-Tk) 25 para realizar la asignación taxonómica de los SGB (ver "Métodos)". Los resultados mostraron que se clasificaron en 20 filos bacterianos y un filo de arqueas, el 90,74 % de los SGB se asignaron a géneros conocidos y el 73,47 % de los SGB fueron especies no clasificadas (denominadas uSGB) (Fig. 1C). Además, el 45,04% de 1048 SGB se asignaron a Firmicutes A, el 25,86% a Bacteroidetes, el 6,97% a Firmicutes y el 5,63% a Proteobacteria (Tabla complementaria 3). La prevalencia y clasificación de SGB en TP, EP y CP se muestran en la Fig. 1D, lo que indica las diferencias de comunidad microbiana a nivel de filo entre tres grupos. Además, los perfiles de genes funcionales de 1048 SGB se predijeron utilizando MetaGeneMark (v.3.38)26 (ver "Métodos"). Todas las anotaciones de genes se realizaron utilizando las bases de datos de enzimas activas de carbohidratos (CAZymes) 27 y la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) Orthology (KO) 28 (ver "Métodos").

A Perfiles de media y alta calidad de MAGs. Tamaño del genoma, N50 y número de contigs de genomas de calidad media y alta con diferentes colores que indican diferente calidad del genoma. Los datos de origen relacionados se proporcionan como un archivo de datos de origen. B Integridad estimada y contaminación de 8210 genomas recuperados de metagenomas de tripa de cerdo. La calidad del genoma se calificó como integridad − 5 contaminación, y solo se conservaron los genomas con una puntuación de calidad superior al 75 %. Los genomas de calidad media se muestran en verde y los de alta calidad en rojo. Histogramas a lo largo de los ejes x e y que muestran el porcentaje de genomas en diferentes niveles de integridad y contaminación, respectivamente. Los datos de origen relacionados se proporcionan como un archivo de datos de origen. C Números de SGB en cada rango taxonómico. Los SGB sin genomas de referencia existentes a nivel de especie por GTDB-Tk se definieron como SGB desconocidos (uSGB), en cambio, los SGB que tenían al menos un genoma de referencia se consideraron como SGB conocidos (kSGB). D Árbol filogenético de SGB representativos de tripa de cerdo. El círculo interior es un árbol filogenético de 1048 SGB representativos coloreados de acuerdo con las clasificaciones taxonómicas de nivel de filo GTDB (consulte la leyenda de colores). Anillos concéntricos que se mueven hacia afuera del primer al tercer anillo que representan SGB enriquecidos en grupo de acuerdo con la presencia/ausencia de SGB en cada grupo. Los TP representan cerdos tibetanos que pastan libremente, los EP representan cerdos europeos cautivos de baja altitud y los CP representan cerdos chinos cautivos de baja altitud. Los datos de origen relacionados se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Chen et al.29 identificaron 6339 MAG (>50 % de integridad y <5 % de contaminación) y 2673 SGB (ANI ≥ 95 %) del conjunto de datos del microbioma intestinal de 500 cerdos chinos. Para explorar la singularidad de nuestros SGB identificados, integramos nuestros MAG 8210 con el conjunto de datos de Chen y mantuvimos los MAG con >75 % de integridad y <5 % de contaminación para la identificación de SGB en el umbral de ANI ≥ 95 %. Finalmente se obtuvieron un total de 2266 SGB. 1248 (55,08%) de ellos fueron exclusivos del estudio de Chen, 519 (22,90%) de este estudio y 499 (22,02%) se superpusieron (Figura 1 complementaria). Este hallazgo indica que se necesitan esfuerzos continuos para comprender la diversidad microbiana del intestino porcino.

Los análisis de diversidad alfa y beta de la microbiota intestinal de cuatro grupos (TP, CP, EP-Dinamarca, EP-Francia) se realizaron en función de la prevalencia o abundancia de SGB (ver "Métodos"). Los resultados demostraron que los índices de riqueza de especies, diversidad de Shannon y Simpson aumentaron significativamente en los TP en comparación con otros grupos (Fig. 2A, prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p < 0,001). El análisis de coordenadas principales (PCoA) (basado en la matriz de distancia de UniFrac ponderada) y el análisis de trazado de escala multidimensional no métrica (NMDS) (basado en la matriz de distancia de Jaccard) indicaron consistentemente una clara separación de los TP de los otros grupos (Fig. 2B, Fig. 2A, B complementaria). Además, la diferencia en la diversidad microbiana entre los tipos de muestras (fecales y ciegos) fue significativamente menor que entre los grupos de huéspedes (Figura complementaria 2C-F), lo que sugiere que los TP albergan una microbiota intestinal distinta. Por ejemplo, el 14,12%, el 8,97% y el 1,43% de todos los SGB estaban presentes únicamente en TP, EP y CP, respectivamente (Fig. 2C). Según la presencia o ausencia de cada SGB en cada muestra, encontramos que 464 SGB se asociaron significativamente con TP, 209 SGB con EP y 146 SGB con CP (Tabla complementaria 4, prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p < 0.05, FDR corregido). A nivel de filo, la prevalencia de Fibrobacterota y Elusimicrobia fue significativamente mayor en los TP que en los EP y CP (Fig. 2D; Fig. 2E, prueba de Fisher, p < 0,001). En cambio, Methanobacteriota, conocida por su papel en la metanogénesis30, fue extremadamente significativamente menor en los TP que en otros grupos (prueba de Fisher, p < 0,001). Los CP tuvieron la mayor prevalencia de Methanobacteriota (prueba de Fisher, p < 0,001). Tanto los TP como los CP tenían mayor prevalencia de Actinobacteriota y Verrucomicrobiota que los EP (test de Fisher, p < 0,01). Desulfobacterota y Planctomycetotah existieron principalmente en CP (prueba de Fisher, p < 0,001), y Deferribacterota y Verrucomicrobiota_A estuvieron prominentemente presentes en EP (prueba de Fisher, p < 0,05).

Una comparación de los índices de diversidad alfa del microbioma intestinal entre TP, EP y CP. El diagrama de violín y el diagrama de caja que representan la riqueza de especies, el índice de diversidad de Shannon y Simpson, respectivamente. Gráfica de barras de riqueza de especies basada en la presencia o ausencia de SGB en cada muestra, índice de diversidad de Shannon y Simpson basado en la abundancia relativa de SGB en cada muestra. Los colores indican grupos de huéspedes. Los datos de origen relacionados se proporcionan como un archivo de datos de origen. B Comparación de la diversidad beta entre TP, EP y CP. PCoA se basó en la matriz de distancia UniFrac ponderada entre muestras. Los colores y las formas indican grupos de huéspedes y tipos de muestras, respectivamente. Gráfico de PCoA que muestra la comunidad microbiana de TP separados de los de EP y CP (por análisis de varianza multivariante mutacional, p = 0,001, R2 ajustado = 0,44). El análisis de trazado B NMDS se basó en la matriz de distancia Jaccard entre muestras. Los colores y las formas indican grupos de huéspedes y tipos de muestras, respectivamente. El trazado de NMDS demuestra la comunidad microbiana de TP separada de los EP y CP (estrés = 0,13). Los datos de origen relacionados se proporcionan como un archivo de datos de origen. C Distribución de SGBs entre TPs, EPs y CPs. Diagrama de Venn que muestra la prevalencia de SGB en TP, EP y CP. Los colores indican grupo de muestra. D Distribución de microbiota a nivel de filo entre TP, EP y CP. Gráfico circular que muestra la prevalencia de filos en TP, EP y CP. E, Comparación del análisis de enriquecimiento a nivel de filo entre TP, EP y CP. Color y tamaño del gráfico de burbujas correspondiente a la prevalencia de SGB en un determinado filo. El mapa de calor muestra el nivel de significación del enriquecimiento (sin * que representa p > 0,05), y los colores indican grupos enriquecidos.

Para investigar el potencial de la utilización de carbohidratos de los SGB asociados a grupos de huéspedes, realizamos la anotación de CAZyme usando dbCAN231 y realizamos un análisis de enriquecimiento de CAZymes a través de la prueba de Fisher (ver "Métodos"). Los resultados demostraron que las SGB asociadas a TP codificaban muchos más genes de utilización de carbohidratos que las SGB asociadas a cerdos cautivos, y los genes pertenecían principalmente a familias de glucósido hidrolasas (GH), familias de carbohidrato esterasas (CE) y familias de polisacáridos liasas (PL) (Tabla complementaria 5 y Fig. 3, test de Fisher, p < 0,05). Por ejemplo, los SGB asociados a TP incluían más genes en GH43, CE12, GH105, GH88, GH35 y GH51 que en CP y EP (prueba de Fisher, p < 0,001). También incluyeron más genes en CE1, PL1 y GH53 que en CP, y genes en GH127 y GH146 que en EP, respectivamente (prueba de Fisher, p < 0,05). Con base en la base de datos CAZy y dbCAN-PUL, encontramos que todos los CAZymes de GH43, CE12, GH105, GH35 y GH51 estaban asociados con la degradación de polisacáridos vegetales, como celulosa, pectina, quitina, xilano y otros glucanos. GH88 está relacionado con la utilización de N-glicano y glicosaminoglicano. CE1, PL1, GH53, GH127 y GH146 están involucrados en la degradación de múltiples polisacáridos, como celulosa, hemicelulosas y otros beta-glucanos. Estos hallazgos sugieren que el microbioma intestinal de los TP tiene una capacidad de utilización de polisacáridos significativamente más fuerte que los cerdos cautivos.

Mapa de calor que muestra la diferencia significativa en CAZimas (excepto glicosiltransferasas) entre TP, EP y CP, y sus posibles sustratos relacionados. Solo demuestra los CAZymes significativamente enriquecidos en el grupo huésped anterior.

La Fibrobacterota y Elusimicrobia existieron principalmente en TP en lugar de otros grupos (prueba de Fisher, p <0,001). En particular, los SGB en los dos filos de bacterias fueron todos de alta calidad con > 90 % de integridad y < 5 % de contaminación (Tabla complementaria 2). Por lo tanto, realizamos la anotación KO y el análisis de enriquecimiento de las vías KEGG para descifrar su potencial funcional. Los resultados mostraron que había 38 vías KEGG significativamente enriquecidas en los SGB de Fibrobacterota y 39 vías en los SGB de Elusimicrobia, respectivamente (Tabla complementaria 6, prueba de Fisher, p < 0,05, FDR corregido). En general, los dos filos de bacterias exhibieron diferentes características metabólicas, aunque las diez vías más enriquecidas en ambos incluyeron traducción, replicación y reparación, transducción de señales y metabolismo energético (Fig. 4, prueba de Fisher, p < 0.001). Fibrobacterota participó particularmente en el metabolismo de los cofactores y las vitaminas, así como en el metabolismo de los aminoácidos, y Elusimicrobia participó principalmente en la biosíntesis y el metabolismo de los glicanos, así como en el metabolismo de los carbohidratos. Además, las vías enriquecidas involucradas en el metabolismo de los aminoácidos fueron distintas entre Fibrobacterota y Elusimicrobia (Fig. 4 y Tabla complementaria 6, prueba de Fisher, p <0.05, FDR corregido). Por ejemplo, Fibrobacterota se enriqueció significativamente en las rutas de biosíntesis de valina, leucina e isoleucina (prueba de Fisher, p = 0,002), metabolismo de alanina, aspartato y glutamato (prueba de Fisher, p = 0,010), biosíntesis de arginina (prueba de Fisher, p = 0,014). ), biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano (test de Fisher, p = 0,023), biosíntesis de lisina (test de Fisher, p = 0,025), metabolismo de histidina (test de Fisher, p = 0,025), metabolismo de cisteína y metionina (test de Fisher, p = 0,032 ). Elusimicrobia prefirió la biosíntesis de lisina (test de Fisher, p = 0,0174), y el metabolismo de glicina, serina y treonina (test de Fisher, p = 0,0277).

Gráfico de burbujas que muestra las vías KEGG significativamente enriquecidas en Elusimicrobia y Fibrobacterota. La importancia del enriquecimiento (valor p) se midió con la prueba de Fisher (ver "Métodos"). El color de la burbuja responde a la importancia del enriquecimiento y el tamaño de la burbuja está relacionado con la proporción del número de genes asignados a una ruta determinada. El mismo color de las vías metabólicas a la derecha indica el mismo módulo de vía.

El análisis de la ruta metabólica demostró que los SGB en Fibrobacteres y Elusimicrobiota contenían una serie de genes enzimáticos clave en la ruta de la glucólisis (10 genes) y la ruta del metabolismo del piruvato (2 genes) para catalizar la conversión de glucosa 6-fosfato en piruvato y luego en corto. ácidos grasos de cadena (SCFA), ácidos grasos de cadena media (MCFA), lactato, etanol, etc. (Fig. 5, Fig. 3 complementaria y Tabla 7 complementaria). Además, codificaron numerosos genes de enzimas para la síntesis de ácidos grasos, la conversión de acetil-CoA en malonil-CoA, así como la síntesis de ácido octanoico, ácido decanoico y ácido dodecanoico. Sin embargo, los SGB en Fibrobacteres codificaron más genes enzimáticos en estas vías que en Elusimicrobiota, excepto en las vías de síntesis de lactato, butanoato, etanol y propanoato. Fue notable que los SGB en dos filos codificaran algunos genes de enzimas únicos para participar en un determinado proceso catalítico. Por ejemplo, los SGB en Fibrobacteres solo estaban involucrados en la síntesis de ácido acético a través de dos vías. Uno fue la conversión de piruvato directamente en ácido acético. Otro fue el piruvato en adenilato de acetilo y luego en ácido acético. Los SGB en Elusimicrobiota simplemente estaban involucrados en la conversión directa de piruvato en lactato. Ciertamente, algunas vías pueden requerir la intercooperación de los dos filos, como la síntesis de butanoato. Las enzimas clave trans-2-enoil-CoA reductasa [EC: 1.3.1.44] y butirato quinasa [EC: 2.7.2.7] se anotaron de los SGB en Fibrobacteres y en Elusimicrobiota, respectivamente.

Elusimicrobia y Fibrobacterota participaron en la degradación de polisacáridos, el transporte de membrana, la glucólisis y el ciclo TCA, así como en el anabolismo de ácidos grasos, aminoácidos y vitaminas B y cofactores. DHAP dihidroxiacetona fosfato, GAP gliceraldehído 3-fosfato, PRPP 5-fosforribosil difosfato, 3PG 3-fosfoglicerato, PEP fosfoenolpiruvato, AIR amino imidazol ribonucleótido, IMP inosina monofosfato, GTP guanosina 5′-trifosfato, D-Ru5P d-ribulosa 5-fosfato, FAD flavina adenina dinucleótido, FMN riboflavina-5-fosfato, DHF 7,8-dihidrofolato, THF tetrahidrofolato, AL (S)-2-acetolactato, OIV 2-oxoisovalerato, NAD+ nicotinamida adenina dinucleótido, NADP+ nicotinamida adenina dinucleótido fosfato.

Además, abundantes genes de enzimas que catalizan el proceso de las ramas no oxidativas de la vía de las pentosas fosfato fueron codificados por los SGB en Fibrobacteres y Elusimicrobiota (Fig. 3 complementaria). Por ejemplo, transcetolasa [EC:2.2.1.1], ribulosa-fosfato 3-epimerasa [EC:5.1.3.1], ribosa 5-fosfato isomerasa A [EC:5.3.1.6] y ribosa-fosfato pirofosfoquinasa [EC:2.7. 6.1] catalizan la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato (eritrosa-4P) y en 5-fosfo-alfa-D-ribosa 1-difosfato (PRPP). Se sabe que la eritrosa-4P es el sustrato esencial para la síntesis del corismato a través de la ruta del shikimato. El chorismato puede servir como precursor para la biosíntesis de tirosina, fenilalanina y triptófano. Y PRPP es el precursor clave para la síntesis de histidina y la formación de ribonucleótido de aminoimidazol (AIR) y trifosfato de guanosina (GTP), que se utilizan para la biosíntesis de vitamina B1, B2, B9, dinucleótido de flavina y adenina (FAD), mononucleótido de flavina (FMN). ) y tetrahidrofolato (THF).

Los análisis de enriquecimiento en las vías metabólicas de Fibrobacteres y Elusimicrobiota ilustraron que los dos filos estaban involucrados en la síntesis de 20 aminoácidos esenciales (Fig. 5, Fig. 4 complementaria y Tabla 7 complementaria). Los SGB en Fibrobacteres codificaron más genes de enzimas relacionados que los de Elusimicrobiota. Por ejemplo, los SGB en Fibrobacteres contenían todos los genes de enzimas clave que catalizaron PRPP para formar histidina (9 genes), oxaloacetato a glutamato y luego arginina (11 genes), oxaloacetato a aspartato (1 gen), aspartato a lisina (7 genes) y a treonina (5 genes), así como a glicina (7 genes), 3-fosfoglicerato a serina (3 genes), piruvato a alanina (2 genes) y valina (5 genes), eritrosa-4P a corismato y además del triptófano (12 genes). Los resultados indicaron que Fibrobacteres tenía una mayor capacidad para sintetizar aminoácidos que Elusimicrobiota. Los SGB en Elusimicrobiota codificaron los siete genes de enzimas clave en la ruta de síntesis de lisina (7 genes) y todos los genes de enzimas clave catalizaron la conversión de treonina en glicina y luego en serina, como la treonina 3-deshidrogenasa [EC: 1.1.1.103].

Además, los SGB en Fibrobacteres y Elusimicrobiota contenían múltiples genes de enzimas en las vías de síntesis de las vitaminas B y sus formas activas, con la excepción de la piridoxina y la cobalamina (Fig. 4 complementaria). Por ejemplo, los SGB en dos filos de bacterias incluyeron 10 genes en la vía de síntesis de tiamina, 13 genes en niacina, nicotinamida y nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+), 11 genes en pantotenato y coenzima A (CoA), 13 genes en biotina, así como 19 genes en hemo. Fue notable que Fibrobacteres tuviera todos los genes de enzimas esenciales para catalizar GTP para formar riboflavina (7 genes), folato y THF (12 genes), lo que indica sus funciones importantes en la síntesis de vitaminas B. Los SGB en Elusimicrobiota contenían más genes de enzimas en la síntesis de niacina y nicotinamida.

En este estudio, recuperamos 8210 MAG de varias razas de cerdos y las agrupamos en 1050 SGB. Al menos el 73,47 % de los SGB pertenecían a nuevas especies bacterianas no identificadas. En comparación con el conjunto de datos más grande del microbioma porcino29, todavía había 519 SGB únicos en este estudio. Estos hallazgos sugieren que este estudio puede ampliar el repertorio de especies conocidas y expandir la diversidad filogenética conocida de la microbiota en el intestino del cerdo. Además, los TP tenían más diversidad microbiana que los CP y los EP, lo que concordaba con el hallazgo de que los macacos rhesus chinos en el Tíbet poseían una mayor diversidad microbiana intestinal que la de los parientes de baja altitud32. Sin embargo, Zeng et al.14 encontraron menos diversidad microbiana en cerdos tibetanos y tibetanos que en sus parientes de baja altitud. Worthmann et al.33 informaron que la exposición al frío resultó en una menor riqueza y una disminución del índice de diversidad de Shannon en ratones. Es necesario aclarar aún más si la gran altitud impulsa la formación de la diversidad microbiana intestinal de los animales tibetanos. Además, encontramos que la diferencia de diversidad beta entre los tipos de muestra (heces frente a contenido de ciego) fue significativamente menor que entre los grupos de huéspedes. Esto fue consistente con nuestro hallazgo anterior de que la diferencia en la diversidad microbiana entre los sitios a lo largo del intestino humano fue menor que la variación entre individuos34.

Nuestro estudio anterior demostró la evolución convergente de los microbiomas del rumen en yak y ovejas tibetanas para la persistencia de recolección de energía de sus anfitriones35, lo que indica que la homeostasis energética mediada por los microbiomas intestinales podría ser vital para la adaptación de los mamíferos a una gran actitud. En este estudio, identificamos cantidades más grandes de genes de enzimas con el potencial de degradar polisacáridos, celulosa y otros beta-glucanos, hemicelulosa, quitina y pectina en genomas microbianos asociados con TP, lo que concuerda con el estudio anterior de que los microbiomas intestinales de Los TP codificaron abundantes genes de enzimas degradantes de carbohidratos que los de sus parientes de baja altitud20. Además, descubrimos una prevalencia significativamente alta de Fibrobacterota y Elusimicrobia en el intestino de los TP. Estuvieron involucrados en la producción de energía, como butirato, ácido acético, propionato, etanol y lactato. El butirato puede ser absorbido por las células del epitelio colónico para mantener la integridad de la barrera de la pared intestinal y prevenir la inflamación de los enterocitos36. El ácido acético y el propionato se absorbieron en el torrente sanguíneo y viajaron al hígado para alimentar el metabolismo energético de los tejidos37. Zheng et al.38 demostraron que Elusimicrobia podía utilizar la glucosa para fermentar en lactato y ácido acético, lo que coincidía con nuestro hallazgo. Por lo tanto, inferimos que la microbiota intestinal única albergada en los TP podría mejorar la utilización de la dieta rica en fibra para promover el metabolismo energético para la adaptación del huésped a entornos extremos a gran altura.

La hipoxia a gran altura y la UVR son características típicas en la meseta de Qinghai-Tíbet2. La privación severa de oxígeno podría aumentar las tasas de incidencia de daño pulmonar39, enfermedades cardiovasculares40 y lesiones cerebrales41. Dado que la exposición a la radiación ultravioleta alta resultó en el envejecimiento prematuro de la piel y muchos otros trastornos de la piel influenciados por el medio ambiente42. En este estudio, encontramos potenciales funcionales de Fibrobacterota y Elusimicrobia en la producción de lactato, aminoácidos (es decir, histidina y arginina) y vitaminas/cofactores (es decir, B2, B3, B9, THF y hemo) (Fig. 5 , Fig. 3 complementaria y Fig. 4 complementaria) se asociaron con la resistencia a la hipoxia y al daño por UVR. Por ejemplo, el lactato se consideró un promotor de la respuesta hipóxica independiente del factor inducible por hipoxia (HIF) al unirse a la proteína NDRG3 para promover la angiogénesis y el crecimiento celular43. La arginina es un precursor del óxido nítrico (NO), que se considera el vasodilatador natural para aumentar el flujo sanguíneo y el suministro de oxígeno44. La histidina se puede convertir en histamina para desempeñar un papel particularmente importante en el aumento del flujo sanguíneo y la permeabilidad capilar45. También se puede convertir en trans-uretano y luego en cis-uretano por UVR para proteger la piel46. La riboflavina y sus cofactores fueron beneficiosos para mantener saludables las células sanguíneas, proteger la salud de la piel y mejorar la resistencia a la hipoxia en adultos jóvenes47,48. El folato y el THF jugaron un papel vital en la represión de la inflamación inducida por la hipoxia49, la formación de glóbulos rojos y la producción de melanina para la protección de la piel50. La nicotinamida y la niacina participaron en la prevención del daño al tejido pulmonar51, así como NAD+ en la prolongación tanto de la salud como de la vida52. El hemo es el precursor importante de la hemoglobina, que es esencial para la detección de oxígeno, la transferencia de oxígeno y la transferencia de electrones53,54. Estos hallazgos mostraron una asociación inesperada entre el microbioma intestinal y la adaptación del huésped a la hipoxia de gran altitud y la UVR.

Nuestro estudio proporciona información para comprender el papel del microbioma intestinal en la adaptación de los mamíferos a la gran altitud y muestra algunos microbios candidatos para la exploración de probióticos en el futuro, como los miembros de Fibrobacterota y Elusimicrobia que están significativamente asociados con la gran altitud. mamíferos y potencialmente contribuir a la adaptación del huésped a ambientes extremadamente duros en la meseta de Qinghai-Tíbet. Sin embargo, todavía no podemos desentrañar por completo el efecto de los diferentes estilos de vida en la divergencia del microbioma intestinal entre los cerdos tibetanos y sus parientes de las tierras bajas. En el futuro, es necesario confirmar nuestras asociaciones descubiertas entre el microbioma intestinal y los rasgos del huésped mediante el uso de modelos animales libres de gérmenes colonizados por bacterias intestinales cultivadas bajo experimentos controlados.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Yunnan para experimentos con animales.

Se recolectaron muestras frescas de contenido de ciego (n = 34) y muestras de heces (n = 31) de 47 cerdos tibetanos que pastaban libremente (machos y hembras) ubicados a 3500 m sobre el nivel del mar en la prefectura de Deqen en la provincia de Yunnan en China en tubos de recolección estériles ( Tabla complementaria 1). Todas las muestras se congelaron inmediatamente en hielo seco y luego se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Las extracciones de ADN se realizaron con el kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con pasos adicionales de ruptura mecánica y precipitado de proteína con acetato de amonio. La concentración y la pureza del ADN se midieron utilizando NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, EE. UU.) y electroforesis en gel de agarosa. La preparación de la biblioteca de metagenomas se realizó en una biblioteca de extremos emparejados de ADN con un tamaño de inserción de 300 pares de bases (pb) para cada muestra siguiendo las instrucciones del fabricante (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). La muestra se secuenció en una plataforma Illumina HiSeq × 10 adoptando una estrategia de secuenciación de PE de 150 pb.

Recopilamos el conjunto de datos metagenómicos disponible públicamente de Xiao et al. study21, con un total de 1758 Gb de lecturas de alta calidad depositadas en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el código de acceso PRJEB11755. Las lecturas sin procesar de secuenciación se generaron a partir de 287 cerdos cautivos de baja altitud (100 cerdos de Francia, 100 cerdos de Dinamarca y 87 cerdos de China) con un promedio de 6,13 Gb por muestra. Estos conjuntos de datos se integraron con nuestras lecturas sin procesar para un mayor ensamblaje metagenómico.

Nuestras lecturas sin procesar y las lecturas disponibles públicamente se filtraron para eliminar las secuencias de baja calidad, incluidas las siguientes: (1) más del 40 % de las bases continuas cuyo puntaje de calidad era inferior a 32 pb; (2) más del 10% de bases N. Luego, se controló aún más la calidad de las lecturas mediante el uso de Trimmomatic para filtrar adaptadores de lecturas de mala calidad y lecturas de menor calidad55. Obtuvimos un total de 2,3 Tb de lecturas limpias de alta calidad para 352 muestras con un promedio de 6,6 Gb por muestra. Se utilizó MEGAHIT (v1.0)56 para ensamblar todas las lecturas limpias en cada muestra individualmente. Los cóntigos con una longitud > 500 pb se alinearon con las lecturas usando BWA (v.0.7.12)57. Luego se calcularon la cobertura y la profundidad de los contigs utilizando Samtools (v.1.9)58 y Bedtools (v.2.27.1)59. Realizamos MetaBAT260 para agrupar los contigs ensamblados en genomas putativos (MAG) dentro de cada muestra en función de la frecuencia de tetranucleótidos y la abundancia (o profundidad promedio) de contigs. Posteriormente, se utilizó CheckM (v.1.0.7)61 para estimar la integridad y contaminación de MAG por genes marcadores específicos de linaje y parámetros predeterminados. En general, los MAG recuperados con integridad > 50 % y contaminación < 10 % se consideraron de calidad media o alta62,63,64, pero establecimos un umbral más estricto para calidad media como integridad > 75 % y contaminación < 10 %22,23 . Los MAG con una integridad > 75 % y una contaminación < 10 % se conservaron para su posterior refinamiento y validación. Usamos RefineM (v.0.0.14)22 para filtrar los contenedores con propiedades genómicas divergentes, con clasificación taxonómica incongruente y con genes de ARNr 16 S incongruentes usando parámetros predeterminados. Se volvió a ejecutar CheckM (v.1.0.7) para evaluar la calidad del genoma de los MAG retenidos. Se obtuvieron 8210 MAG de calidad media-alta (integridad 75% y contaminación 10%). Luego, esos MAG se agruparon en genomas a nivel de especie usando dRep (v.2.6.2)65 con parámetros predeterminados de Mash66 y ANIs67 (en el umbral del 95%). Los genomas con la máxima puntuación de calidad del genoma (integridad-contaminación 5X + 0,5 logN50) en cada grupo se seleccionaron como SGB representativos. Se determinó que las SGB con una cobertura superior al 40 % en una muestra estaban presentes en esta muestra. Entonces, en este estudio finalmente se reconstruyó un total de 1048 SGB representativos en tripa de cerdo (Tabla complementaria 2).

GTDB-Tk (v.1.4.0)25 se utilizó para realizar asignaciones taxonómicas de 1048 SGB representativos basados en GTDB (versión 95) (Tabla complementaria 3). Los árboles filogenéticos de los SGB fueron construidos por FastTree (v.2.1.10)68 y visualizados usando iTOL (v.6.6)69.

Los marcos abiertos de lectura (ORF) se predijeron utilizando MetaGeneMark (v.3.38)26 en cada SGB. Todos los ORF se asignaron a la base de datos de genes KEGG (v.96) para anotar los KO y se alinearon con la base de datos CAZy usando dbCAN231 para anotar CAZymes. Los sustratos de carbohidratos de los genes que contienen CAZyme se obtuvieron utilizando la base de datos dbCAN-PUL.

La riqueza de especies se calculó en función de la presencia o ausencia de cada SGB en cada muestra (consulte el archivo de datos de origen) por paquete vegano. El índice de diversidad de Shannon y Simpson se calculó en función de la abundancia de cada SGB en cada muestra (consulte el archivo de datos de origen) por paquete vegano. La abundancia o profundidad de cada SGB se calculó con base en la fórmula: longitud total de la base mapeada en el genoma dividida por el tamaño del genoma. La diferencia estadística en la diversidad alfa entre los cuatro grupos se midió empleando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. El análisis de trazado de PCoA se realizó en función de la matriz de distancia UniFrac ponderada entre muestras mediante el uso del paquete Phyloseq. El análisis de trazado de NMDS se realizó con base en la matriz de distancia de Jaccard entre muestras utilizando el paquete Vegan. El análisis de enriquecimiento de cada SGB en cada grupo se midió en función de su presencia o ausencia en cada muestra. La diferencia estadística en cada enriquecimiento de SGB entre tres grupos se analizó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Los SGB enriquecidos en cada grupo se anotaron CAZymes y luego, de acuerdo con el recuento de CAZymes anotados en cada grupo, realizamos el análisis de enriquecimiento utilizando la prueba exacta de Fisher. Todos los SGB de phyla Fibrobacteres y Elusimicrobiota se asignaron a sus KO anotados. Utilizamos la prueba exacta de Fisher para analizar el enriquecimiento de la ruta KEGG de cada filo en función de la proporción de recuentos de KO anotados y recuentos de KO totales en la ruta determinada.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuencia sin procesar y los perfiles de MAG se han depositado en el archivo de secuencias CNGB (CNSA) de la base de datos del banco nacional de genes de China (CNGBdb) con el número de acceso CNP0003325. También están disponibles en https://db.cngb.org/qtp/. Los datos fuente subyacentes a las Figs. 1–2 y las figuras complementarias 1–2 se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La información detallada del código utilizado para realizar nuestros análisis de datos está disponible en los materiales complementarios.

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Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación y Expedición Científica de la Segunda Meseta Tibetana (STEP) (NO. 2019QZKK0503), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NO. U2002206 y 31970571), el Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología en la provincia de Yunnan de China (NO . 202001BB050001), el Programa de investigación clave de la Academia de Ciencias de China (NO. KFZDSW-219) y el Proyecto de innovación en investigación de posgrado de la Universidad de Yunnan (NO. KC-22221159).

Estos autores contribuyeron por igual: Fangfang Zhao, Lili Yang, Tao Zhang.

State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming, Yunnan, 650091, China

Fangfang Zhao, Tao Zhang, Daohua Zhuang, Qunfu Wu, Jiangkun Yu, Chen Tian y Zhigang Zhang

Laboratorio clave de biotecnología de animales herbívoros de Gansu, Facultad de ciencia y tecnología animal, Universidad agrícola de Gansu, Lanzhou, Gansu, 730070, China

Colmillo Zhao

Laboratorio Estatal Clave de Recursos Genéticos y Evolución, Laboratorio de Genómica Evolutiva y Funcional, Instituto de Zoología de Kunming, Academia de Ciencias de China, Kunming, Yunnan, 650201, China

Lili Yang, Qunfu Wu y Zhigang Zhang

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ZGZ concibió y diseñó la investigación. Datos analizados de DHZ, FFZ, CT, LLY y TZ. QFW contribuyó a la recogida de muestras. JKY contribuido a los métodos. FFZ y ZGZ escribieron el manuscrito. ZGZ revisó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final antes de enviarla.

Correspondencia a Zhigang Zhang.

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Reimpresiones y permisos

Zhao, F., Yang, L., Zhang, T. et al. Firmas de microbioma intestinal de adaptación al medio ambiente extremo en cerdo tibetano. npj Biofilms Microbiomes 9, 27 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00395-3

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Recibido: 09 Agosto 2022

Aceptado: 10 de mayo de 2023

Publicado: 24 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00395-3

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