El efecto de los extractos de Alnus incana (L.) Moench en la mejora de la sobrecarga de hierro

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7635 (2023) Citar este artículo

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La sobrecarga de hierro provoca disfunción multiorgánica y daños graves. Alnus incana de la familia Betulaceae, ampliamente distribuida en América del Norte, se utiliza para el tratamiento de enfermedades. En este estudio, investigamos las actividades quelantes de hierro, antioxidantes, antiinflamatorias y antiapoptóticas del extracto total y de butanol de Alnus incana en ratas sobrecargadas de hierro e identificamos los componentes bioactivos en ambos extractos mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas. Indujimos una sobrecarga de hierro en las ratas mediante seis inyecciones intramusculares de 12,5 mg de hierro dextrano/100 g de peso corporal durante 30 días. A continuación, se administró a las ratas 60 mg de sulfato ferroso/kg de peso corporal una vez al día mediante una sonda gástrica. Los extractos total y de butanol se administraron por vía oral y el fármaco de referencia (deferoxamina) se administró por vía subcutánea durante otro mes. A los dos meses evaluamos los parámetros bioquímicos, histopatológicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos. La sobrecarga de hierro aumentó significativamente el nivel de hierro sérico, las actividades de los biomarcadores hepáticos, el contenido de hierro hepático, el malondialdehído, el factor de necrosis tumoral alfa y los niveles de caspasa-3. También redujo sustancialmente (P < 0,05) la albúmina sérica, la proteína total y el contenido total de bilirrubina, y redujo los niveles hepáticos de glutatión. Causó graves alteraciones histopatológicas en comparación con las ratas de control, que mejoraron notablemente (P < 0,05) después del tratamiento. El extracto total exhibió actividades antiinflamatorias y antiapoptóticas significativamente más altas, pero menor actividad antioxidante y quelante de hierro que el extracto de butanol. Se detectaron varios compuestos polifenólicos, incluidos flavonoides y ácidos fenólicos, mediante cromatografía líquida de ultrarendimiento, ionización por electropulverización, espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (UPLC-ESI-QTOF-MS). Nuestros hallazgos sugieren que ambos extractos podrían aliviar la hepatoxicidad inducida por la sobrecarga de hierro y otras condiciones patológicas caracterizadas por la sobrecarga hepática de hierro, incluidas la talasemia y la anemia de células falciformes.

La toxicidad por sobrecarga de hierro se ha relacionado con hemocromatosis hereditaria, talasemia y enfermedades hepáticas, incluidas la hepatitis crónica y alcohólica1. La mayoría de los pacientes con β-talasemia homocigota tienen anemia progresiva grave que requiere transfusiones de sangre vitales periódicas, aunque algunos siguen siendo independientes de las transfusiones2. Debido a la transfusión crónica y al aumento de la absorción gastrointestinal, el hierro se acumula en muchos órganos y tejidos, lo que provoca una disfunción multiorgánica progresiva, incluidos el hígado, el corazón y las glándulas endocrinas3. La sobrecarga de hierro no diagnosticada puede causar hemocromatosis, en la que el exceso de hierro almacenado en los órganos provoca un daño tisular grave. Además, la sobrecarga de hierro es común en los países industrializados debido al consumo generalizado de carnes rojas y suplementos de hierro4. Etiológicamente, las disfunciones de múltiples órganos están vinculadas a la presencia de un exceso de hierro libre que eleva el daño oxidativo al generar especies reactivas de oxígeno (ROS)5 y agotar los niveles de antioxidantes intracelulares6. El depósito de hierro en las células hepáticas aumenta significativamente el riesgo de fibrosis y cirrosis, aumentando en consecuencia la morbilidad y la mortalidad7. Además, las ROS liberadas pueden causar inflamación hepática mediante la inducción de mediadores proinflamatorios específicos, incluidos el factor nuclear kappa B (NF-κB) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), que contribuyen a la patogenia y el desarrollo de hepatopatías agudas y crónicas. daño, culminando en cirrosis8. Por lo tanto, la homeostasis del hierro debe preservarse manteniendo un suministro adecuado de hierro y evitando la acumulación excesiva de hierro.

Los medicamentos quelantes de hierro utilizados actualmente, como la deferiprona, la deferoxamina y el deferasirox, tienen varios efectos secundarios indeseables, que incluyen agranulocitosis, insuficiencia hepática o renal, toxicidad ocular, ototoxicidad y retraso del crecimiento9,10.

En comparación con los medicamentos fabricados, los remedios a base de hierbas son más seguros y tienen menos efectos adversos. Además, varias plantas son abundantes en productos químicos bioactivos con potentes actividades farmacológicas11,12. El género Alnus perteneciente a la familia Betulaceae incluye aproximadamente 30 especies de árboles y trepadoras. Alnus incana (L.) Moench se distribuye ampliamente en el hemisferio norte y se ha utilizado para tratar enfermedades gastrointestinales y de la piel13. También se usa para hacer gárgaras durante las infecciones bacterianas de la boca y la garganta14. Se ha informado que esta especie contiene compuestos naturales conocidos como diarilheptanoides con diferentes actividades farmacológicas, que incluyen antiinflamatoria, antiinfluenza y hepatoprotectora. Aunque Sajid et al.15 y Kim et al.16 informaron que las actividades hepatoprotectoras de las especies estrechamente relacionadas, Alnus nitida y Alnus japonica, respectivamente, esta actividad aún no se ha informado en extractos de A. incana.

Recientemente, los científicos han estado investigando cada vez más las plantas medicinales que contienen abundantes fitoquímicos quelantes naturales con alto contenido fenólico y potente actividad antioxidante para usarlas en la eliminación de hierro en pacientes talasémicos17,18. Por lo tanto, este estudio investigó las posibles actividades hepatoprotectoras, quelantes de hierro, antioxidantes, antiinflamatorias y antiapoptóticas del extracto de metanol total y la fracción de butanol de las hojas de Alnus incana sobre la hepatotoxicidad mediada por sobrecarga de hierro en ratas. También identificamos los componentes bioactivos en ambos extractos mediante cromatografía líquida de ultrarendimiento, ionización por electropulverización, espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo (UPLC-ESI-QTOF-MS).

El análisis fitoquímico del extracto total mostró la presencia de taninos, compuestos fenólicos, flavonoides, alcaloides, saponinas, cumarinas, terpenoides, antraquinonas y β-cianinas (Cuadro 1).

Los extractos de butanol y total revelaron una inhibición dependiente de la dosis de la actividad de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) con valores de concentración inhibitoria media máxima (IC50) de 0,015 y 7,55 µg/ml, respectivamente. Por otra parte, la CI50 en las fracciones de éter de petróleo y cloruro de metileno fue de 229 y 29,06 µg/ml, respectivamente. Todas las concentraciones, tanto del extracto total como de la fracción de butanol, inhibieron significativamente los radicales libres en comparación con las fracciones de cloruro de metileno y éter de petróleo (P < 0,05) (Fig. 1). Por lo tanto, evaluamos los posibles efectos de mejora del extracto total de Alnus incana y la fracción de butanol contra la hepatotoxicidad inducida por la sobrecarga de hierro en ratas albinas macho.

Actividad depuradora de DPPH de diferentes extractos de A. incana versus rutina estándar. Los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos. aSignificativamente diferente del extracto de éter de petróleo, bSignificativamente diferente del extracto de cloruro de metileno.

El contenido total de fenoles y flavonoides del extracto total resultó ser de 125,88 ± 10,5 mg equivalentes de ácido gálico (GAE)/g y 122,4 ± 11,5 mg equivalentes de catequina (CE)/g respectivamente, mientras que el de la fracción butanólica fue de 245 ± 18,5 GAE/g y 100 ± 9,8 mg CE/g, respectivamente (Tabla 2).

Se identificaron cincuenta y cuarenta y tres compuestos polifenólicos en el extracto total y la fracción de butanol de A. incana, respectivamente, incluidos flavonoides (35, 29), ácidos fenólicos (8,7), estilbenos (1, 1), cumarina (2, 2) , y diarilheptanoides (4, 4), respectivamente (Tabla 3). Los flavonoides comprendían agliconas y O- o C-glicósidos de flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas, chalconas y antocianidinas. Los estilbenos, chalconas, antocianidinas y ácidos fenólicos representaron las clases de mayor concentración (800,38 %, 247,81 %, 247,29 %, 242,39 % y 101,49 %, respectivamente) en la fracción de butanol en comparación con el extracto total. Además, la daidzeína-8-C-glucósido, la malvidina-3-glucósido y la oregonina fueron los compuestos de mayor abundancia en la fracción de butanol en comparación con el extracto total calculado a partir del área del pico (Tabla 3).

Los flavonoides identificados del extracto total y la fracción de butanol de A. incana incluyeron quercetina, miricetina, baicalina, baicaleína, apigenina, naringenina, puerarina y malvidina-3-glucósido, que se identificaron a partir de sus espectros de masas al revisar la base de datos de la biblioteca y la literatura disponible (Figura Suplemento 1).

Durante todo el período experimental, no se observaron signos de toxicidad aguda ni mortalidad a dosis de hasta 1000 mg/kg de peso corporal (p.c.). Por lo tanto, la dosis de fracción de butanol se seleccionó como 100 mg/kg pc para estudios adicionales.

El grupo con sobrecarga de hierro reveló una disminución sustancial (P < 0,05) en los niveles de albúmina y proteína total y un marcado aumento (P < 0,05) en el nivel de bilirrubina total, actividades de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) en comparación con sus controles (Cuadro 4). El tratamiento con ambos extractos y el fármaco de referencia elevó notablemente (P < 0,05) los niveles de albúmina y proteínas totales y disminuyó significativamente (P < 0,05) el nivel de bilirrubina total, la ALT y las actividades de AST en comparación con las ratas sobrecargadas de hierro. Además, el extracto de butanol mostró niveles sustancialmente más altos de los parámetros mencionados anteriormente que las ratas tratadas con el fármaco de referencia.

El grupo con sobrecarga de hierro reveló un contenido de hierro sérico y hepático considerablemente mayor que el control (P < 0,05). Sin embargo, la administración del extracto total, fracción de butanol y deferoxamina a las ratas sobrecargadas de hierro disminuyó significativamente estos parámetros en comparación con el grupo sobrecargado (P < 0,05). El nivel de hierro sérico en las ratas tratadas con extracto de butanol fue sustancialmente más bajo que el de las ratas tratadas con extracto total (P < 0,05) sin ninguna diferencia significativa (P > 0,05) de los niveles en las ratas tratadas con el fármaco de referencia. El tratamiento con extracto de butanol disminuyó significativamente el contenido de hierro hepático en comparación con los tratados con el extracto total y el fármaco de referencia (P < 0,05) (Fig. 2a yb).

Contenido de hierro hepático (a), nivel de hierro sérico (b), GSH (c), MDA (d), TNF-α (e) y niveles de Caspasa-3 (f) entre diferentes grupos experimentales. C: Grupo de control, sobrecarga de hierro: grupo de sobrecarga de hierro, sobrecarga de hierro + T: sobrecarga de hierro + grupo tratado con extracto total, sobrecarga de hierro + B: sobrecarga de hierro + grupo tratado con fracción de butanol, sobrecarga de hierro + D: sobrecarga de hierro + deferoxamina- grupo tratado. Los resultados se expresan como media ± SEM (n = 6 ratas/grupo). a significativamente diferente del control, b significativamente diferente del grupo con sobrecarga de hierro, c significativamente diferente del grupo con sobrecarga de hierro + B, d significativamente diferente del grupo con sobrecarga de hierro + D.

La administración de hierro sustancialmente (P < 0,05) elevó el contenido de malondialdehído hepático (MDA) y, al mismo tiempo, redujo el contenido de glutatión reducido hepático (GSH) en comparación con sus controles normales. Mientras que el tratamiento con ambos extractos y el fármaco de referencia redujo significativamente el contenido de MDA y aumentó el contenido de GSH en comparación con las ratas tratadas con hierro (P < 0,05). La reducción en el nivel de MDA fue notablemente mayor en el extracto de butanol que en el extracto total. Por el contrario, el tratamiento con extracto de butanol no mostró una diferencia significativa (P > 0,05) en el nivel de GSH en comparación con el grupo control (Fig. 2c y d).

La sobrecarga de hierro aumentó significativamente el nivel de TNF-α hepático y la actividad de caspasa-3 en comparación con sus valores de control (P <0.05) (Figs. 2e y f). Por el contrario, la administración del extracto total, la fracción de butanol y el fármaco de referencia a animales sobrecargados de hierro redujo sustancialmente estos parámetros en comparación con las ratas sobrecargadas (P < 0,05). Las ratas tratadas con el extracto total mostraron un nivel de TNF-α y una actividad de caspasa-3 significativamente más bajos (P < 0,05) que las ratas tratadas con la fracción de butanol.

Las secciones de hígado de las ratas de control mostraron una arquitectura histológica normal. El hígado constaba de la vena central con placas hepáticas regulares separadas por sinusoides hepáticos. Cada placa hepática contenía grandes hepatocitos poligonales con núcleo central, redondeado y vesicular (Fig. 3a). Sin embargo, las ratas sobrecargadas de hierro exhibieron daño hepático severo, incluyendo dilatación y congestión de la vena central y los sinusoides hepáticos, cordones hepáticos desordenados, degeneración hepatocelular con vacuolización citoplasmática, depósitos de hierro de color marrón amarillento, infiltración de células inflamatorias entre los hepatocitos y en el área portal. junto con dilatación y congestión de la vena porta (Fig. 3b-f). Por el contrario, los grupos cotratados revelaron una marcada atenuación en la lesión hepática inducida por sobrecarga de hierro. Las ratas sobrecargadas de hierro cotratadas con extracto total de Alnus incana exhibieron una mejora notable en la estructura histológica con leve dilatación y congestión de la vena central y leve degeneración hepatocelular (Fig. 3g). Las secciones de hígado del grupo IV exhibieron un parénquima hepático aparentemente normal con solo leve dilatación y congestión de la vena central y leve degeneración hepatocelular (Fig. 3h). Por el contrario, la coadministración con deferoxamina restauró notablemente el parénquima hepático con cordones hepáticos dispuestos en línea recta, dilatación moderada y congestión de la vena central junto con degeneración hepatocelular leve y vacuolización citoplasmática (Fig. 3i).

Microfotografías representativas de secciones de tejido hepático de diferentes grupos experimentales (H&E, × 400): (a) Grupo de control que muestra una arquitectura histológica normal de tejido hepático con vena central (VC) y placas hepáticas regulares (flecha) separadas por sinusoides hepáticos (punta de flecha) ( b:f) Grupo con sobrecarga de hierro que muestra daño hepático grave, que incluye dilatación y congestión de la vena central (estrella) y sinusoides hepáticos (punta de flecha blanca), cordón hepático alterado, degeneración hepatocelular con vacuolización citoplasmática (flecha blanca), depósitos de hierro de color marrón amarillento (flecha amarilla), infiltración de células inflamatorias entre los hepatocitos (círculo) y en el área porta (punta de flecha amarilla) junto con dilatación y congestión de la vena porta (VP). ( g: i ) Grupos cotratados (III, IV y V) que demuestran una atenuación marcada en la lesión hepática inducida por sobrecarga de hierro acompañada de una disminución en la acumulación de hierro (flecha amarilla). ( g ) Grupo sobrecargado de hierro cotratado con extracto total de Alnus incana que muestra una notable mejoría en la estructura histológica con leve dilatación y congestión de la vena central (estrella) y leve degeneración hepatocelular (flecha blanca). (h) Grupo con sobrecarga de hierro cotratado con extracto de butanol de Alnus incana que revela un parénquima hepático aparentemente normal con solo dilatación leve y congestión de la vena central (estrella) y degeneración hepatocelular leve (flecha blanca). (i) El grupo con sobrecarga de hierro cotratado con deferoxamina restauró notablemente el parénquima hepático con cordones hepáticos dispuestos en línea recta (punta de flecha), dilatación moderada y congestión de la vena central (estrella) junto con degeneración hepatocelular leve y vacuolización citoplásmica (flecha blanca).

Nuestros resultados (Tabla 5) mostraron que la puntuación de lesión histopatológica más alta se observó en el grupo con sobrecarga de hierro (II). Por el contrario, los grupos cotratados (III, IV y V) revelaron una marcada reducción en todas las puntuaciones de lesiones microscópicas.

Se realizó tinción de Prusia para visualizar la distribución de depósitos de hierro en las secciones de tejido hepático y confirmar la variación entre los diferentes grupos experimentales. Las secciones de hígado del grupo de control no mostraron depósitos de hierro (Fig. 4a). Por el contrario, el pigmento azul representó los depósitos de hierro en el citoplasma de los hepatocitos, el intersticio y el área portal en los otros grupos tratados (Fig. 4b-m). La acumulación de hierro hepático más alta se observó en las ratas sobrecargadas de hierro (Fig. 4b-d) con un % de área promedio (33,92 ± 0,57, Fig. 4n) en comparación con otros grupos cotratados (Fig. 4e-m). Mientras que el tratamiento con extracto total (Fig. 4e-g) y butanólico (Fig. 4h-j), así como con deferoxamina (Fig. 4k-m) atenuó notablemente (P < 0,05) la acumulación de hierro hepático con un porcentaje de área medio (21,25 ± 0,78 , 18,33 ± 0,59 y 22,59 ± 0,47, respectivamente, Fig. 4n).

Fotomicrografías que representan la distribución (a–m) y la cuantificación (n) de los depósitos de hierro teñidos con azul de Prusia en las secciones de tejido hepático de diferentes grupos. (a) Grupo control, (b:d) Grupo sobrecargado de hierro, (e:g) Grupo sobrecargado de hierro cotratado con extracto total de Alnus incana, (h:j) Grupo sobrecargado de hierro cotratado con extracto butanólico y (k :m) Grupo sobrecargado de hierro cotratado con deferoxamina. (a,b,e,h,k: × 100) (c,f,i,l: Gran aumento del área central, × 400) (d,g,j,m: Gran aumento del área del portal, × 400). ( n ) Cuantificación del % de área positiva de tinción con azul de Prusia en el tejido hepático de ratas. Los resultados se expresan como Media ± SEM a significativamente diferente del control, b significativamente diferente del grupo con sobrecarga de hierro, c significativamente diferente del grupo con sobrecarga de hierro + B, d significativamente diferente del grupo con sobrecarga de hierro + D.

Las secciones de hígado del grupo con sobrecarga de hierro (Fig. 5b) mostraron una inmunorreactividad positiva más fuerte para la caspasa 3 que el grupo de control (Fig. 5a). Mientras que el grupo con sobrecarga de hierro cotratado con el extracto total o la fracción de butanol o deferoxamina reveló una inmunorreactividad de caspasa 3 moderada en comparación con el grupo II (Fig. 5c-e, respectivamente).

Microfotografías de secciones de hígado teñidas con caspasa 3 de ratas en los diferentes grupos experimentales (x 400). (a) Grupo de control, (b) Grupo con sobrecarga de hierro, (c) Grupo con sobrecarga de hierro cotratado con extracto total de Alnus incana, (d) Grupo con sobrecarga de hierro cotratado con butanol, y (e) Grupo con sobrecarga de hierro co- tratados con deferoxamina.

Las secciones de hígado del grupo con sobrecarga de hierro (Fig. 6b) mostraron una inmunorreactividad positiva más alta para NF-κB que el grupo de control (Fig. 6a). Por el contrario, el grupo con sobrecarga de hierro cotratado con extracto total (grupo III) o fracción de butanol (grupo IV) o deferoxamina (grupo V) reveló una inmunorreactividad de NF-κB más leve que el grupo II (Fig. 6c-e, respectivamente).

Microfotografías de secciones de hígado teñidas con NFκB de ratas en los diferentes grupos experimentales (x 400). (a) Grupo de control, (b) Grupo con sobrecarga de hierro, (c) Grupo con sobrecarga de hierro cotratado con extracto total de Alnus incana, (d) Grupo con sobrecarga de hierro cotratado con butanol, y (e) Grupo con sobrecarga de hierro co- tratados con deferoxamina.

Los resultados actuales revelaron que el nivel de hierro hepático se correlacionó significativamente con TNF-α hepático, caspasa-3, MDA, nivel de hierro sérico, ALT, AST y nivel de bilirrubina total, donde r = 0.813**, 0.833**, 0.798** , 0,823**, 0,845**, 0,813** y 0,910** respectivamente. Por otro lado, se observó una correlación negativa significativa entre el contenido de hierro hepático y el contenido de GSH hepático, albúmina sérica y proteína sérica total donde r = − 0,798** − 0,87** y − 0,869** respectivamente (**P < 0,01). De manera similar, el nivel de hierro sérico se correlacionó significativamente con el nivel hepático de TNF-α, caspasa-3, MDA, ALT, AST y bilirrubina total, donde r = 0.791**, 0.750**, 0.933**, 0.792**, 0.786* *, y 0,865** respectivamente. Además, el nivel de hierro sérico se correlacionó negativamente con el GSH hepático, la albúmina sérica y la proteína total, donde r = −0,798**, −0,830** y −0,779**, (**P < 0,01).

El hierro, un microelemento esencial, tiene varias funciones vitales en los organismos vivos19,20. Sin embargo, la sobrecarga de hierro, que ocurre debido a intoxicaciones, enfermedades y condiciones patológicas, puede inducir disfunción multiorgánica, incluido el daño hepático21. Los quelantes de hierro utilizados actualmente, como la deferiprona, la deferoxamina y el deferasirox, causan varios efectos secundarios indeseables, que incluyen agranulocitosis, neutropenia, trastornos gastrointestinales e insuficiencia hepática o renal9,10. Estas desventajas de los agentes quelantes de hierro actuales resaltan la innovación para intervenciones farmacológicas alternativas y seguras. Ebrahimzadeh et al.18 demostraron que los extractos de hierbas con alto contenido fenólico podrían actuar como quelantes o adyuvantes para tratar la sobrecarga de hierro. Por lo tanto, aquí, evaluamos los potenciales antioxidantes, quelantes de hierro, antiinflamatorios y antiapoptóticos del extracto de metanol de las hojas de Alnus incana y su fracción de butanol contra la hepatotoxicidad inducida por sobrecarga de hierro.

Nuestros resultados indicaron que la ingesta excesiva de hierro aumentó los niveles séricos y hepáticos de hierro, acompañado de alteraciones significativas en la función hepática y la peroxidación lipídica. Posteriormente, esto resultó en mecanismos de defensa antioxidantes deficientes y apoptosis de los tejidos hepáticos. Estos hallazgos se alinean con Badria et al.22 y Al-Basher23.

Con base en nuestros resultados, las ratas sobrecargadas de hierro revelaron actividades enzimáticas ALT y AST séricas significativamente elevadas y niveles de bilirrubina total, pero albúmina sérica y proteína total más bajas, de acuerdo con Al-Basher23. Además, el contenido de hierro hepático se correlacionó significativamente con la ALT sérica hepática, la AST y el nivel de bilirrubina total, donde r = 0,845**, 0,813**, 0,910**, respectivamente (**P < 0,01). Mientras que el contenido hepático de hierro se correlacionó negativamente con la albúmina sérica y la proteína sérica total, donde r = −0,87** y −0,869**, respectivamente (**P < 0,01). Estos resultados estuvieron acompañados de un aumento significativo en el % de área media (33,92 ± 0,57) de acumulación de hierro hepático, así como alteraciones histopatológicas severas en forma de dilatación y congestión de la vena central y sinusoides hepáticos, cordones hepáticos desordenados, degeneración hepatocelular con vacuolización citoplasmática e infiltración de células inflamatorias. Estos hallazgos son consistentes con Jahanshahi et al.24 y Wang et al.25. La elevación sustancial de la función hepática indica daño hepático, que posteriormente afecta la función de transporte de los hepatocitos y fugas, lo que resulta en la liberación de ALT y AST26,27. Además, estas alteraciones histopatológicas podrían afectar las funciones hepáticas e inducir hipoalbuminemia e hipoproteinemia. Además, el contenido excesivo de hierro provoca una disfunción significativa de los hepatocitos, lo que conduce a la falla de la absorción, conjugación y excreción normales, y al aumento subsiguiente del nivel de bilirrubina total28.

Sin embargo, la administración de ambos extractos redujo notablemente los niveles de AST, actividades de ALT y bilirrubina total y aumentó los niveles de albúmina y proteína total en comparación con las ratas sobrecargadas de hierro. En el grupo tratado con extracto de butanol, los parámetros se restauraron a sus rangos normales, acompañados de una marcada reducción en el % de área media de los depósitos de hierro hepático con una estructura del parénquima hepático significativamente mejorada. Estos hallazgos sugieren el potente efecto antioxidante de ambos extractos, como lo demuestra la medición de la actividad de eliminación de radicales libres (Fig. 1). Estos efectos antioxidantes podrían deberse a la presencia de flavonoides y polifenoles en estos extractos, que pueden estabilizar y mantener la integridad de la membrana celular del hígado, estimular la regeneración de los hepatocitos, atenuar y reparar el tejido dañado y, posteriormente, mejorar la actividad enzimática del hígado. y síntesis de proteínas hepatocelulares29,30. Además, la administración de butanol redujo significativamente el contenido hepático de hierro en comparación con las tratadas con el extracto total y el fármaco de referencia, lo que sugiere que tiene una mejor actividad quelante del hierro que el extracto total en las ratas con sobrecarga de hierro.

Los perfiles fitoquímicos del extracto total y la fracción de butanol de A. incana se identificaron mediante análisis UPLC-ESI-QTOF-MS. Los datos mostraron que el extracto total y la fracción de butanol eran ricos en varios polifenoles y diarilheptanoides.

La mayor actividad quelante de hierro de la fracción de butanol podría atribuirse a la mayor abundancia de daidzeína-8-C-glucósido, malvidina-3-glucósido y oregonina en esta fracción que en el extracto total (Tabla 3). Se ha informado que los compuestos antes mencionados exhibieron actividad quelante del hierro a través de diferentes mecanismos de acción31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Además, los flavonoides son la principal clase de componentes identificados en los extractos de A.incana y pueden quelar metales de manera más eficiente que otros polifenoles, lo que sugiere que pueden usarse para tratar potencialmente la sobrecarga de hierro. Según Wang et al.42, los flavonoides combaten la acumulación de hierro a través de tres mecanismos principales: (1) reduciendo la saturación de hierro indirectamente a través de múltiples proteínas y vías, como la ferritina y la hepcidina; (2) quelar el hierro para disminuir la acumulación de hierro, lo que disminuye directamente la saturación de hierro a través de los sitios de unión, como la estructura 6,7-dihidroxi, el catecol del anillo B y el doble enlace 2,3. También se ha informado que la baicalina, la baicaleína y la quercetina exhiben una actividad significativa de quelación del hierro; (3) resistencia a la oxidación para disminuir el daño oxidativo de la sobrecarga de hierro al reaccionar con radicales de anión superóxido para evitar la iniciación de radicales libres, suprimir la reacción de Fenton para evitar la generación de radicales hidroxilo y reaccionar con grupos de peroxidación de lípidos para evitar la peroxidación de lípidos. Este efecto puede deberse a mayores cantidades de polifenoles en el extracto de butanol que en el extracto total (Cuadro 2). Los polifenoles ejercen sus actividades antioxidantes a través de diferentes mecanismos, incluidos los potenciales de eliminación de radicales libres y la unión al hierro. En general, los metales de transición que involucran hierro promueven la producción de radicales libres de oxígeno, reducen el peróxido e interactúan con los aniones superóxido, lo que genera estrés oxidativo. Se ha encontrado que los polifenoles poseen capacidades de unión al hierro; estas actividades se deben principalmente a la presencia de grupos como catecol y galoilo. Además, algunas investigaciones revelaron que la estructura 6,7-dihidroxi, el catecol del anillo B, los grupos galoilo, el doble enlace 2,3 y los grupos 3- y 5-hidroxilados en coexistencia con el grupo 4-ceto están vinculados a la capacidad de quelación, por lo que son dignos de ser considerados como sitios de unión al hierro42.

En este estudio, el exceso de contenido hepático de hierro indujo una elevación sustancial (P ˂ 0.05) en el contenido hepático de MDA junto con una marcada disminución (P ˂ 0.05) en el nivel hepático de GSH en los grupos con sobrecarga de hierro en comparación con los de control. Estos hallazgos indican estrés oxidativo a través de la mejora de la peroxidación lipídica, formación excesiva de radicales libres y mecanismo antioxidante deficiente, lo que posteriormente conduce a disfunción hepática y fuga de enzimas hepáticas43,44. Papanikolaou y Pantopoulos45 demostraron que el exceso de hierro crea radicales libres, que inducen daño a las macromoléculas celulares y potencian la muerte celular. Nuestros resultados sugieren una correlación significativa entre el contenido de hierro hepático y el nivel de MDA (r = 0,798**) y una correlación negativa entre el contenido de hierro hepático y el contenido de GSH (r = −0,798**). Por el contrario, el tratamiento con extracto total y fracción de butanol atenuó el estrés oxidativo inducido como lo demuestra una marcada elevación (P ˂ 0.05) en el contenido de GSH y una disminución significativa (P ˂ 0.05) en el nivel de MDA en comparación con las ratas sobrecargadas de hierro. Estos resultados podrían atribuirse a los antioxidantes que se encuentran en ambos extractos. El extracto de butanol reveló mayores efectos antioxidantes que el extracto total. Como esta fracción contiene un mayor contenido de polifenoles (245 mg GAE/g) que el extracto total (126 mg GAE/g, Tabla 2), la actividad antioxidante se correlaciona con la concentración de polifenoles46. Los polifenoles naturales son potentes antioxidantes porque pueden eliminar los radicales libres, quelar metales, convertir los productos de oxidación primarios en moléculas no radicales, romper la cadena para evitar la pérdida continua de hidrógeno de los sustratos y regular las enzimas antioxidantes47.

Nuestro estudio confirmó que la apoptosis inducida por sobrecarga de hierro se manifiesta por una potente inmunorreactividad de caspasa 3 con una actividad de caspasa 3 hepática marcadamente elevada (P ˂ 0.05). Esto se correlacionó sustancialmente con el contenido de hierro hepático. Investigaciones anteriores demostraron que el estrés oxidativo inducido por el exceso de hierro, que a su vez causó daño a la membrana mitocondrial interna e inició la apertura de los poros mitocondriales. Como resultado, se agota el trifosfato de adenosina (ATP) y se libera citocromo c en el citosol que posteriormente activa la caspasa 3 e induce la muerte celular8,48. La activación de la caspasa 3, un mediador crucial de la apoptosis, provoca la fragmentación del ADN y la condensación de la cromatina apoptótica en las células49. Por lo tanto, el exceso de hierro promueve la necrosis o apoptosis de las células hepáticas, ya sea solo o en combinación con el estrés oxidativo48. Además, nuestros resultados demostraron que la inflamación es otro posible mecanismo de hepatotoxicidad inducida por sobrecarga de hierro, ya que el grupo de sobrecarga de hierro reveló una actividad de TNF-α hepática significativamente mayor (P ˂ 0.05) acompañada de una fuerte expresión inmunohistoquímica de NF-κB. Handa et al.50 reportaron que la suplementación excesiva de hierro induce estrés oxidativo en las células del hígado, iniciando mediadores inflamatorios e inmunes así como daño por balonización hepatocelular, lo que resulta en el pronóstico de esteatohepatitis no alcohólica. El TNF-α, una citocina multifuncional, es crucial para diversos mecanismos fisiológicos y patológicos, como la inflamación, la apoptosis y la necrosis51. Además, el TNF-α activa las vías de señalización de NF-κB mediante la activación de los receptores tipo toll, lo que da como resultado una mayor expresión inmunohistoquímica de NF-κB52,53. La activación de NF-κB puede iniciar y regular la expresión de una serie de citocinas inflamatorias implicadas en la inflamación54,55. Además, NF-κB está regulado por la generación excesiva de ROS y muchas citocinas, incluida la interleucina-1 beta56. Nuestros resultados demostraron que ambos extractos tienen potentes actividades antiinflamatorias y antiapoptóticas manifestadas por una inmunorreactividad leve de NF-κB, una expresión inmune moderada de caspasa 3 con actividades sustancialmente (P ˂ 0.05) más bajas de TNF-α hepático y caspasa 3 que el grupo con sobrecarga de hierro. Esto podría atribuirse a la potente capacidad antioxidante de estos extractos, junto con su capacidad para quelar e inhibir el contenido de hierro hepático. Además, el extracto total exhibió actividades antiinflamatorias y antiapoptóticas más altas que el extracto de butanol, posiblemente debido a los efectos sinérgicos de varios compuestos polifenólicos, incluidos ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos, cumarinas, ligninas y taninos, que presentan propiedades antiinflamatorias y antiapoptóticas. actividades antiapoptóticas57,58,59,60,61,62. Además, también se detectaron en este extracto otras clases, a saber, saponinas, terpenoides, antraquinonas y diarilheptanoides, que muestran actividades similares63,64,65,66 (Tabla 1).

Nuestros resultados indican que el tratamiento con deferoxamina reduce significativamente el contenido de hierro sérico y hepático y los biomarcadores hepáticos (AST y ALT), de acuerdo con Mansi et al.20, Jahanshahi et al.24 y Wang et al.25. Además, este tratamiento redujo significativamente los niveles elevados de MDA, TNF-α y caspasa-3 y aumentó los contenidos de GSH, de acuerdo con Wang et al.25. Además, la deferoxamina atenuó significativamente el depósito hepático de hierro, mejoró el daño hepático y disminuyó la inmunorreactividad de caspasa-3 y NF-κB inducida por la sobrecarga de hierro, lo que se alinea con las observaciones de Jahanshahi et al.24 y Wang et al.25. Estos resultados se atribuyen a su potente actividad quelante. Heli et al.67 informaron que los quelantes de hierro podrían disminuir el estrés oxidativo al eliminar el exceso de hierro de los tejidos objetivo.

Nuestro estudio demostró que tanto los extractos totales como los de butanol de Alnus incana podrían quelar notablemente el exceso de hierro y mejorar la hepatotoxicidad inducida por la sobrecarga de hierro en ratas al reducir el contenido sérico y hepático de hierro, las actividades de los biomarcadores hepáticos, disminuir el estrés oxidativo, inhibir la inflamación y la apoptosis, lo que resulta en contenido significativamente más alto de albúmina sérica, proteína total y bilirrubina total, y actividad antioxidante endógena mejorada. Además, pueden paliar las alteraciones histopatológicas e histoquímicas inducidas por la sobrecarga de hierro debido a su contenido fitoquímico. Estos hallazgos sugieren que ambos extractos podrían representar un tratamiento novedoso para la hepatotoxicidad inducida por la sobrecarga de hierro y otras afecciones patológicas caracterizadas por la sobrecarga hepática de hierro, incluidas la talasemia y la anemia de células falciformes.

Todos los productos químicos eran de alto grado analítico y se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La deferoxamina se adquirió de Novartis Pharma AG (Basilea, Suiza).

Las hojas de Alnus incana (L.) Moench se recolectaron con permiso del jardín de investigación Al Zoharia siguiendo las pautas institucionales, nacionales e internacionales. El Dr. Mamdouh Shokry, botánico del Jardín de Investigación Al Zoharia en El Cairo, Egipto, validó y autenticó el material vegetal. Se depositó un espécimen de comprobante en el herbario del Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Farmacia (Chicas), Universidad de Al-Azhar con el número (AR-2016).

El material vegetal secado al aire (1 kg) se extrajo macerándolo a fondo con metanol al 100% (3x, 3 L) y se filtró a través de papel de filtro (Whatman nº 1). El filtrado recolectado se secó al vacío (45 °C) en un evaporador rotatorio para obtener el extracto total. Luego, 350 g del extracto total se suspendieron en agua destilada, luego se fraccionaron sucesivamente usando solventes de gradiente de polaridad, incluidos éter de petróleo, cloruro de metileno y n-butanol. Las fracciones se filtraron y evaporaron en un evaporador rotatorio usando una temperatura adecuada para obtener las fracciones de éter de petróleo (60 g), cloruro de metileno (220 g) y n-butanol (12 g).

Realizamos pruebas cualitativas para detectar las diferentes clases fitoquímicas en los extractos totales y de butanol de las hojas de Alnus incana, según68.

El contenido de fenoles totales se determinó mediante el procedimiento de Folin-Ciocalteu69. El contenido total de flavonoides se cuantificó usando la Farmacopea Estatal de la URSS70.

UPLC-ESI-QTOF-MS es una técnica sofisticada y sensible para identificar metabolitos secundarios de plantas cualitativa y cuantitativamente. Se aplicó una técnica ESI negativa para detectar los diversos fitoconstituyentes en el extracto total de A. incana y la fracción de butanol.

El extracto total de A. incana y la fracción de butanol (100 mg) se disolvieron en 2 mL de metanol:acetonitrilo:agua (1:1:2) mediante agitación vorticial durante 2 min y ultrasonicación durante 10 min. Después de centrifugar durante 10 min a 10.000 rpm, la solución se diluyó hasta alcanzar una concentración final de 2,5 µg/µL. Luego, se usaron 10 µL para inyección en el modo negativo. Las moléculas se separaron utilizando un sistema Axion AC (Kyoto, Japón) conectado a un sistema de muestreador automático con una precolumna de disco de filtro en línea (0,5 µm × 3 mm, Phenomenex, EE. UU.) y un Xbridge C18 (3,5 µm × 2,1 mm × 50 mm) (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.) mantenida a 40 °C y caudal de 300 μL/min. El gradiente de elución se aplicó utilizando la fase móvil, que consiste en formato de amonio 5 mM en metanol al 1 % (pH = 8) y acetonitrilo al 100 %. Se utilizó el sistema Triple TOF™ 5600+ equipado con una fuente Duo Spray™ que funciona en el modo ESI (AB SCIEX, Concord, Canadá) para el análisis de MS. Después de cada escaneo, se seleccionaron los 15 iones más intensos para obtener los espectros de fragmentación MS/MS. Los analitos diana se reconocieron relacionando los datos de LC/MS con la base de datos de referencia (ReSpect negativo, 1573 registros) y compuestos publicados previamente71.

El potencial eliminador de radicales libres de los extractos ha sido evaluado por el método descrito por72. La IC50 para todos los extractos se determinó mediante análisis probit73.

Sesenta ratas Wistar macho (210-230 g) se obtuvieron de la casa de animales de la Organización Nacional para el Control y la Investigación de Drogas. Se mantuvieron en condiciones ambientales estándar que incluían un ciclo regular de luz/oscuridad (12/12 h), 25 °C ± 1 °C de temperatura ambiente y 50% ± 4% de humedad relativa. Después de aclimatarse durante una semana bajo un ciclo de luz natural con ventilación adecuada, se les alimentó con una dieta de gránulos estándar y tuvieron acceso ilimitado al agua.

Treinta ratas fueron igualmente asignadas a cinco grupos (6 ratas/grupo). A todos los grupos se les administró por vía oral dosis crecientes (125, 250, 500 y 1000 mg/kg pc) de la fracción de butanol. El grupo al que se administró el vehículo solo sirvió como control normal. Después de una hora, las ratas se observaron individualmente para detectar cualquier alteración anormal del comportamiento, como somnolencia, inquietud, retorciéndose, convulsiones y otros síntomas de toxicidad y mortalidad. Luego, fueron monitoreados intermitentemente cada 24 h por cualquier síntoma de toxicidad aguda durante 14 días74.

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de El Cairo (n.º de aprobación: Vet Cu 2009 2022484) y se ajustaron a las directrices de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE.

Treinta ratas se asignaron por igual a cinco grupos (6 ratas/grupo) de la siguiente manera:

Las ratas del grupo de control se mantuvieron con agua destilada.

Las ratas del grupo con sobrecarga de hierro recibieron uniformemente seis inyecciones intramusculares de 12,5 mg de hierro dextrano/100 g de peso corporal durante 30 días. Mientras tanto, a las ratas se les administró 60 mg de sulfato ferroso/kg pc usando una sonda gástrica una vez al día.

Grupo sobrecargado de hierro + extracto total de Alnus incana Las ratas sobrecargadas de hierro recibieron por vía oral el extracto metanólico (200 mg/kg pc) según Sajid et al.15 mediante una sonda gástrica una vez al día durante un mes.

Grupo de fracción de butanol + sobrecarga de hierro Las ratas sobrecargadas de hierro recibieron por vía oral una fracción de butanol (100 mg/kg de peso corporal) mediante una sonda gástrica una vez al día durante un mes.

Grupo con sobrecarga de hierro + fármaco de referencia (deferoxamina) Ratas con sobrecarga de hierro inyectadas por vía intraperitoneal con deferoxamina (50 mg/kg pc) según Mirzaei et al.75 una vez al día durante un mes.

Después de dos meses, se recolectaron muestras de sangre de todos los grupos por punción del plexo retroorbitario, se mantuvieron durante 15 min y se centrifugaron durante 15 min para separar el suero que se utilizó para evaluar los parámetros bioquímicos. Después de eso, las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical y sus hígados fueron almacenados para análisis bioquímicos o fijados en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% para una investigación histopatológica adicional.

Las actividades de albúmina sérica, proteína total, bilirrubina total, AST y ALT se evaluaron de acuerdo con kits comerciales adquiridos de Biodiagnostics, El Cairo, Egipto.

El nivel de hierro sérico se estimó utilizando un kit comercial adquirido de Spectrum Diagnostics, El Cairo, Egipto. Las muestras de tejido hepático se homogeneizaron en solución salina tamponada con fosfato fría y, a continuación, se determinó el contenido de hierro hepático en los homogeneizados tal como describe Wootton76.

Los homogeneizados hepáticos se utilizaron para estimar MDA (un biomarcador de peroxidación de lípidos), GSH y la concentración de proteína total según los métodos descritos por Ohkawa et al.77, Ellman78 y Bradford79, respectivamente.

Analizamos la actividad de caspasa-3 y el nivel de TNF-α en el homogeneizado hepático utilizando kits ELISA adquiridos en Cusabio, Alemania.

Las muestras de tejido hepático se fijaron en NBF al 10 %, se procesaron en alcohol y xileno, se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones de 4 µm de espesor con un micrótomo manual y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), como informaron previamente Bancroft y Gamble80. . Detectamos el depósito y la distribución del hierro mediante la tinción con azul de Prusia según Sheehan y Hrapchak81. Las secciones teñidas fueron examinadas y fotografiadas utilizando una cámara fija Olympus.

La puntuación de las lesiones hepáticas se evaluó a ciegas en todos los grupos (6 ratas/grupo), y la gravedad de las lesiones patológicas se midió de la siguiente manera: ninguna (-, estructura normal), cambios leves (+, < 25 %), cambios moderados ( ++, 25-50%), cambios severos (+++, 51-75%) y cambios muy severos (++++, > 75%)44.

Para el análisis de imágenes, se examinaron cinco secciones diferentes teñidas con azul de Prusia (×100) de cada grupo y se cuantificó el porcentaje de área (% de área) de los depósitos de hierro teñidos con azul de Prusia representados por la pigmentación azul usando el programa ImageJ.

Las muestras de hígado de todos los grupos experimentales se sometieron a inmunohistoquímica (IHC) utilizando anticuerpos caspasa 3 y NF-κB. Las secciones de parafina se fijaron en portaobjetos adhesivos, se rehidrataron, se sometieron a recuperación de antígeno por calentamiento, luego se lavaron e incubaron con anticuerpos policlonales primarios contra caspasa 3/CPP32 (forma activa, Diagnostic BioSystems) y NFκB-p65 (Elabscience Biotechnology) a una dilución de 1:100 durante la noche seguido de lavado e incubación con peroxidasa de rábano picante durante 2 h. Después de dos lavados, se usó un kit de diaminobencidina para desarrollar la inmunotinción y el color marrón representó una inmunorreactividad positiva.

Los resultados obtenidos se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM). Se utilizó ANOVA unidireccional en el análisis estadístico, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey utilizando SPSS versión 21.0. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El coeficiente de correlación se estimó mediante regresión lineal según Abdel-Daim et al.82.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Financiamiento de acceso abierto proporcionado por The Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) en cooperación con The Egyptian Knowledge Bank (EKB). Esta investigación no recibió una subvención específica de ninguna agencia de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.

Departamento de Farmacognosia y Plantas Medicinales, Facultad de Farmacia para Niñas, Universidad Al Azhar, El Cairo, Egipto

Fatma Abo-Elghiet, Shaza A. Mohamed y Abeer Temraz

Departamento de Citología e Histología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, Egipto

Aunque AE Yasin

Organización Nacional para el Control y la Investigación de Drogas, Dokki, El Cairo, Egipto

Walid Hamdy El-Tantawy y Samah Fathy Ahmed

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WHT propuso la concepción del estudio; diseñó los experimentos; análisis estadístico realizado; FA llevó a cabo la investigación fitoquímica e interpretación de los datos fitoquímicos y redactó el artículo, y SAM llevó a cabo la investigación fitoquímica e interpretación de los datos fitoquímicos, SFA realizó la investigación y los estudios bioquímicos, AT realizó el análisis de datos y la revisión final, YNAE llevó a cabo realizó los estudios histopatológicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos y redactó el manuscrito. Todos los autores leyeron, revisaron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Noha AE Yasin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Abo-Elghiet, F., Mohamed, SA, Yasin, NAE et al. El efecto de los extractos de Alnus incana (L.) Moench en la mejora de la hepatotoxicidad inducida por sobrecarga de hierro en ratas albinas macho. Informe científico 13, 7635 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34480-6

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Recibido: 14 diciembre 2022

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 11 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34480-6

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