El bermellón y el cinabrio están involucrados en la biosíntesis del pigmento omocromo en los ojos pero no en las alas de las mariposas Bicyclus anynana

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9368 (2023) Citar este artículo

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Si el mismo pigmento se encuentra en diferentes tejidos de un cuerpo, es natural asumir que las mismas vías metabólicas se implementan de manera similar en cada tejido. Aquí mostramos que este no es el caso de los omocromos, los pigmentos rojos y naranjas que se encuentran en los ojos y las alas de las mariposas. Probamos la expresión y la función del bermellón y el cinabrio, dos genes de mosca conocidos en la vía del omocromo, en el desarrollo de pigmentos en los ojos y en las alas de las mariposas Bicyclus anynana, ambos rasgos con pigmentos rojizos/anaranjados. Mediante el uso de hibridación fluorescente in situ (HCR3.0), localizamos la expresión de bermellón y cinabrio en el citoplasma de las células pigmentarias en los omatidios, pero no observamos una expresión clara de ninguno de los genes en las alas de larvas y pupas. Luego interrumpimos la función de ambos genes usando CRISPR-Cas9, lo que resultó en la pérdida de pigmento en los ojos pero no en las alas. Usando cromatografía de capa fina y espectroscopia UV-vis, identificamos la presencia de precursores de omocromo y omocromo en las escamas de las alas naranjas y en la hemolinfa de las pupas. Concluimos que las alas sintetizan omocromos localmente, con enzimas aún no identificadas o incorporan estos pigmentos sintetizados en otros lugares de la hemolinfa. Diferentes vías metabólicas o mecanismos de transporte conducen, por tanto, a la presencia de omocromos en las alas y ojos de las mariposas B. anynana.

Los omocromos son pigmentos rojos/naranjas que se encuentran en una variedad de especies que cumplen diversas funciones. Están presentes en las células que contienen pigmentos de crustáceos, arañas e insectos y juegan un papel importante en el patrón de color, el filtrado visual, la protección UV y la desintoxicación de triptófano1. Los omocromos que se encuentran en las células pigmentarias de los omatidios de los insectos, la unidad óptica de los ojos de los insectos, juegan un papel importante en la protección de las células fotorreceptoras y en la pigmentación general de los ojos1,2,3. Los ommocromos que se encuentran en los parches de color rojo y naranja en las alas de las mariposas, como Elymnias hypermnestra tinctoria4, Junonia coenia5,6 y Agraulis vanilla7, probablemente cumplen una función de señalización de atracción de pareja o evitación de depredadores.

Los omocromos se producen a través de la ruta de biosíntesis de los omocromos, cuyas enzimas se han estudiado principalmente en sistemas modelo de insectos como Drosophila melanogaster8, Tribolium castaneum9, Aedes aegypti10 y los lepidópteros Bombyx mori11 y Plutella xylostella12. En esta vía, el aminoácido triptófano se convierte en los pigmentos xantomatina y dihidroxantomatina que pueden ser de color amarillo a rojo dependiendo del entorno reductor de la célula13. En Drosophila, cuatro genes clave que codifican diferentes enzimas en esta vía incluyen bermellón, quinurenina formamidasa (kfase), cinabrio y cardenal12. Después de que el transportador de monocarboxilato putativo karmoisin14 incorpora el triptófano en las células pigmentarias, el bermellón codifica la triptófano oxigenasa que convierte el triptófano en formilquinurenina15. la quinurenina formamidasa (kfase) codifica una enzima homónima que convierte la formilquinurenina en quinurenina16. el cinabrio codifica la quinurenina 3-hidroxilasa que convierte la quinurenina en 3-hidroxiquinurenina12. Por último, cardinal codifica la fenoxazinona sintetasa que cataliza la conversión de 3-hidroxiquinurenina en xantomatina (naranja), que puede convertirse posteriormente en dihidro-xantomatina (roja), en condiciones químicas reductoras13.

Algunos de los mismos genes codificadores de enzimas omocromos, precursores de metabolitos omocromos y un regulador del factor de transcripción omocromo ocular, también se han identificado en las alas de algunas especies de mariposas ninfalidas. En Vanessa cardui, el triptófano se incorpora en los dominios de color rojo y beige del ala17, y la expresión de bermellón y cinabrio está presente en las áreas pigmentadas de color rojo de las alas en desarrollo de Heliconius erato18. Estudios posteriores identificaron a optix como uno de los factores de transcripción clave que regulan la presencia de pigmentos omocromos en mariposas19, porque su desactivación resultó en la pérdida de la pigmentación de color rojo y naranja en múltiples especies de mariposas, así como también condujo a la regulación negativa de omocromos. genes asociados a la vía en las alas20. Sin embargo, no se ha probado el papel directo del bermellón y el cinabrio en la producción de pigmentos omocromos en las alas de las mariposas.

La conexión entre optix y los genes conocidos de la ruta ommochrome tampoco está clara en las mariposas Bicyclus anynana, que debido a su genoma secuenciado y amplias herramientas genéticas para la expresión y el análisis funcional es un buen sistema para estudiar dicha ruta. optix está claramente involucrado en la pigmentación de las futuras células de escamas anaranjadas en los patrones de manchas oculares de las alas de esta especie, ya que su desactivación da como resultado la pérdida del color naranja21. Pero no está claro si los genes conocidos de la vía ommochrome son necesarios para la producción de pigmento naranja en las alas de B. anynana. bermellón se identificó en el extracto de ARNm a granel de alas de pupa de B. anynana en algunos puntos de tiempo22, pero las eliminaciones de bermellón con CRISPR-Cas9 no mostraron ningún efecto visible en las alas23. Además, la eliminación de los transportadores omocromo blanco y escarlata tampoco produjo ningún fenotipo visible en las alas, a pesar de afectar la pigmentación omatidial23. Estos resultados pueden indicar (1) que los genes de la vía omocromática se expresan solo en una pequeña cantidad de células en el ala de B. anynana (el anillo naranja en las manchas oculares), que hasta ahora no han sido atacadas con la herramienta CRISPR; (2) que los omocromos no son los pigmentos anaranjados en B. anynana; o (3) que los omocromos no se producen en las alas de B. anynana, sino que se transportan allí desde otras células productoras de omocromos.

Para examinar la participación de los genes del pigmento omocromo conocidos en las alas de B. anynana, examinamos la expresión y la función del bermellón y el cinabrio mediante hibridación fluorescente in situ y CRISPR-Cas9, respectivamente. También examinamos la expresión y función de ambos genes en los ojos en desarrollo, como control. Nuestros resultados indican que estas dos enzimas omocromas son esenciales para la pigmentación de los ojos, pero no desempeñan un papel importante en la síntesis local de pigmentos en las alas de B. anynana. A continuación, mediante cromatografía en capa fina y espectrometría UV-visible, identificamos la presencia de pigmentos omocromos y precursores omocromos en el anillo naranja de las manchas oculares y en la hemolinfa de B. anynana, respectivamente. Concluimos que los pigmentos omocromos se están incorporando al ala desde otra fuente, o que se están utilizando nuevas enzimas para la síntesis de omocromos en el tejido del ala de esta mariposa.

Para identificar la localización espacial y los patrones de expresión de bermellón y cinabrio, primero probamos el patrón de expresión en los ojos en desarrollo de las mariposas usando HCR3.024. Observamos dominios de expresión claros y distintos en el citoplasma de las células pigmentarias omatidiales para ambos genes (Figs. 1A-F, S1D, E).

Expresión y función de bermellón y cinabrio en ojos de Bicyclus anynana al 77% de desarrollo pupal (PD) (120 h). Expresión de (A) DAPI y (B) bermellón en los ojos. (C) Expresión combinada de DAPI y bermellón. Expresión de (D) DAPI y (E) cinabrio en los ojos. (F) Expresión combinada de DAPI y cinabrio. DAPI se expresa en cuatro núcleos de los omatidios y el ARNm de bermellón y cinabrio está presente en el citoplasma de esas células. Ojos adultos (G) WT, (H) ojos crujientes bermellón y (I) ojos crujientes de cinabrio. los crujientes bermellón mostraron fenotipos mutantes más homogéneos, mientras que los crujientes cinabrio mostraron parches de células sin pigmentación (flecha negra). (J) Se encontraron indels cerca del sitio objetivo del ARN guía para bermellón (recuadro rojo) y para (K) cinabrio.

Luego probamos la expresión de bermellón y cinabrio en las alas de larvas y pupas de B. anynana usando HCR24. Se ha demostrado previamente que el bermellón y el cinabrio tienen una mayor expresión entre el 40 y el 55 % del desarrollo pupal en Vanessa cardui y Heliconius erato17,18, por lo que examinamos la expresión de estos genes hasta esa etapa en B. anynana. Esperábamos un dominio de expresión al menos parcialmente superpuesto al de optix, que se expresa en el anillo naranja de las manchas oculares durante la etapa de pupa (Figs. 2K–M, 3K–M, S1, S2)21,25. Sin embargo, ninguno de los genes mostró ningún dominio específico de expresión en las alas (Figs. 2, 3). Sin embargo, al 77 % (120 h) y al 92 % de PD (144 h), observamos una ligera intensidad homogénea más alta de fluorescencia en las alas, probablemente debido a la autofluorescencia de la quitina durante las últimas etapas de desarrollo del desarrollo del ala de la pupa, como mostraron las tinciones de control. el mismo aumento de fluorescencia (Figs. 2G–J,N,O, 3G–J,N,O).

Expresión de bermellón en las alas larvarias y pupales de Bicyclus anynana. Expresión de bermellón en las alas larvales (A y B), (C y D) 31% desarrollo pupal (PD) (48 h), (E y F) 61,5% PD (96 h), (G y H) 77% PD (120 h), y (I y J) 92% PD (144 h). No se observaron dominios específicos de mRNA bermellón en las alas. (K-M) Coexpresión de bermellón y optix (control positivo) al 77% PD (120 h). Expresión de la hebra con sentido bermellón en (N) el ala anterior y (O) el ala posterior al 77% PD (120 h).

Expresión de cinabrio en las alas larvarias y pupales de B. anynana. Expresión de cinabrio en las alas larvarias (A y B), (C y D) 31% desarrollo pupal (PD) (48 h), (E y F) 61,5% PD (96 h), (G y H) 77% PD (120 h), y (I y J) 92% PD (144 h). No se observaron dominios específicos de ARNm de cinabrio en las alas. (K-M) Coexpresión de bermellón y optix (control positivo) al 77% PD (120 h). Expresión de la hebra con sentido de cinabrio en (N) el ala anterior y (O) el ala posterior al 77 % de PD (120 h).

Para verificar si los genes omocromos se transcriben en las alas de pupa con PD al 15 % (24 h), realizamos PCR en ADNc de ala completa utilizando cebadores específicos para bermellón, cinabrio y quinurenina formamidasa. Los datos muestran que los ARNm para estos genes están presentes en las alas de las pupas en niveles bajos (en comparación con el ef1α de referencia) (Fig. S3), de acuerdo con los datos de RNA-seq de un estudio anterior26 (Tabla S5).

Para validar la función del bermellón y el cinabrio en los ojos y las alas de B. anynana, interrumpimos la secuencia de codificación de ambos genes mediante CRISPR. Mientras que los ojos WT aparecen como negros (Fig. 1G), los adultos bermellón crujiente tenían ojos amarillos o rosados homogéneos (n = 5) (Fig. 1H), y los adultos cinabrio crujiente (n = 6) mostraron una pigmentación más clara en parches de mosaico en los ojos. (Fig. 1I). La mayoría de estos individuos que muestran fenotipos oculares (n = 5 bermellón, n = 4 cinabrio) (Figs. S4, S15) fueron confirmados para indels en el sitio objetivo de CRISPR mediante la secuenciación Illumina del ADN extraído del tejido ocular (Figs. 1J, K , S5–S9, S16–S19).

Los crujientes de bermellón (Figs. 4B-D, S4) y cinabrio (Figs. 5B-D, S15) no produjeron ningún fenotipo de alas. Para confirmar si el bermellón y el cinabrio se eliminaron con éxito en el ala, realizamos una secuenciación de illumina en las alas de cada individuo que mostró fenotipos de pigmentación ocular. Obtuvimos indeles en los sitios objetivo de CRISPR en cada individuo evaluado (n = 5 bermellón, n = 6 cinabrio) (Figs. 4E, S10–S14), (Figs. 5E, S20–S25).

No se detectó ninguna función del bermellón en las alas de Bicyclus anynana. Adultos (A y B) alas WT y (B-D) alas crujientes bermellón. Indels en el sitio de (E) crujientes bermellón de las respectivas alas de (B-D). No se observaron fenotipos específicos ni clones en mosaico en las alas adultas. Las alteraciones genéticas en el sitio objetivo se confirmaron mediante secuenciación illumina. El cuadro rojo resalta el sitio objetivo de CRISPR.

No se detectó ninguna función de cinabrio en las alas de B. anynana. Alas adultas (A) WT y (B-D) alas crujientes de cinabrio. Indels en el sitio de (E) crujientes de cinabrio de las alas respectivas del panel BD. No se observaron fenotipos específicos ni clones en mosaico en las alas adultas. Las alteraciones genéticas en el sitio objetivo se confirmaron mediante secuenciación illumina. El cuadro rojo resalta el sitio objetivo de CRISPR.

Probamos un gen de biosíntesis de omocromo conocido adicional, quinurenina formamidasa (kfase), usando HCR (Fig. S26) y CRISPR (Fig. S27). En este caso, las eliminaciones de kfase no dieron como resultado ningún fenotipo de ojo o ala observable (n = 5) (Fig. S27), a pesar de que las transcripciones estaban claramente localizadas en las células omatidiales durante el desarrollo de la pupa (Fig. S27; Tabla S5 ). No se ha informado ningún mutante kfase conocido para especies de insectos1.

Dado que no pudimos identificar ningún defecto en la pigmentación de las alas con bermellón y cinabrio, teníamos curiosidad por probar si los pigmentos omocromos estaban presentes en la región de escamas anaranjadas de las alas adultas de B. anynana. Extrajimos pigmentos de las escamas anaranjadas de B. anynana, junto con pigmentos de la región anaranjada de dos especies de Junonia, ya que estudios en J. coenia han confirmado previamente omocromos en sus alas5. Realizamos un experimento de cromatografía en capa fina (TLC) con dos pigmentos de control con factores de retención conocidos (Rf), amaranto y azul de bromofenol, para ayudar a identificar la presencia de omocromos (también con Rfs conocidos)17 (Fig. 6). Observamos la presencia de un pigmento con el mismo valor cromatográfico Rf de la dihidroxantomatina en B. anynana (flecha negra, Fig. 6A; Tabla 1). En J. almana, un pigmento con las propiedades de retención de ommatina-D estuvo presente en niveles más altos (flecha naranja, Fig. 6C; Tabla 1), mientras que J. orythia indicó la presencia probable de ommatina-D y xantomatina (naranja y púrpura). flechas, Fig. 6E, Tabla 1). Estos resultados muestran la presencia de omocromos en alas de B. anynana a pesar de la ausencia de función de enzimas biosintéticas de omocromos conocidas en el tejido del ala de esta especie. Sin embargo, los pigmentos en las bandas de TLC necesitan una mayor validación con experimentos de espectrometría de masas.

Cromatografía en capa fina (TLC) sobre los pigmentos extraídos de las secciones naranjas de B. anynana, J. almana y J. orythia. (A,B) Pigmentos extraídos del anillo naranja de B. anynana que muestran una banda en el valor del factor de retención (Rf) de dihidroxantomatina (flecha negra). (C,D) Pigmentos extraídos del anillo naranja de J. almana que muestran una banda en el valor Rf de ommatin-D (flecha naranja). (E, F) Pigmentos extraídos del anillo naranja de J. orythia que muestran una banda en el valor Rf de xantomatina y ommatina-D (flecha violeta y naranja). Los pigmentos de control amaranto y azul de bromofenol migran como pigmentos rojo y azul, respectivamente (flecha roja y azul). El azul de bromofenol tiene dos bandas marrones y amarillas adicionales y el amaranto tiene una banda roja adicional. (G) Espectro UV-Visible del 77 % (120 h) de extracto de pigmento de hemolinfa pupal PD, que muestra tres picos marcados por líneas discontinuas de colores en longitudes de onda que probablemente correspondan a quinurenina (rojo, 366 nm), xantomatina (azul, 440 nm) y dihidro -xantomatina (verde, 470 nm).

Para explorar más a fondo cómo están presentes los omocromos en las alas de B. anynana, probamos la hipótesis de que los omocromos y sus precursores podrían tomarse de la hemolinfa e incorporarse a las escamas de las alas durante el desarrollo pupal. Purificamos los pigmentos de la hemolinfa de individuos al 77% (120 h) PD y obtuvimos sus espectros de absorbancia (Fig. 6G). Observamos picos de absorbancia en varias longitudes de onda de 366 nm, 440 nm y 470 nm. Con base en los valores previamente informados27,28,29, estas longitudes de onda indican la presencia probable de quinurenina, xantomatina y dihidro-xantomatina, respectivamente, en la hemolinfa. Estos resultados indican que uno de los mecanismos por los que aparecen los omocromos en las alas de B. anynana podría ser a través del transporte desde la hemolinfa.

En B. anynana, las enzimas omocromas bermellón y cinabrio se expresan en las células pigmentarias de los omatidios durante el desarrollo de la pupa, donde funcionan en la síntesis de pigmentos. Ambos genes se transcriben en alrededor del 77 % de PD (120 h) en los ojos (Fig. 1A–F) y las transcripciones se detectan tan pronto como el 31 % de PD (48 h) y el 46 % de PD (72 h) (Fig. S1D, E ). En cada omatidio, la expresión se limitó a la periferia, donde se sitúan las células pigmentarias primarias y secundarias1 (fig. 1A-F). La mayoría de los crujientes bermellón tenían un color de ojos naranja pálido homogéneo (Fig. 1H), mientras que los crujientes de cinabrio en su mayoría tenían parches rojos más claros en los ojos (Fig. 1I). Estos resultados son similares a los estudios de expresión en otras especies de insectos como Acheta domesticus y Henosepilachna vigintioctopunctata30,31, y estudios de eliminación de bermellón o cinabrio en Tribolium castaneum, Aedes aegypti, Plutella xylostella, Nasonia vitripennis y Helicoverpa zea, que alteraron los omatidios adultos. coloración9,10,12,15,32.

Ni el bermellón ni el cinabrio juegan un papel funcional en la síntesis del omocromo del ala en B. anynana, a pesar de la presencia de ARNm que codifican tanto las enzimas en las alas de las pupas como la probable presencia de omocromos en el ala adulta. En nuestros experimentos, no se observó una expresión notable de estos genes en las alas y manchas oculares de larvas y pupas antes del 92 % de DP (144 h) (Figs. 2, 3). La validación funcional de estas dos enzimas monocromáticas utilizando CRISPR-Cas9 tampoco resultó en ningún fenotipo observable en las alas de B. anynana (Figs. 4, 5, S4, S15), a pesar de la presencia de un gran porcentaje de lecturas con indels que sugieren knockouts exitosos en la mayoría de las células del ala (Figs. 4, 5, S10–S14, S20–S25). Tanto la falta de una fuerte expresión de bermellón y cinabrio en el ala como la falta de fenotipos CRISPR, a pesar de la confirmación de alteraciones genéticas en estos genes en cada ala de eye crispants exitosos, sugiere que estos genes no juegan un papel en la síntesis de omocromo en el alas de B. anynana. Ya sea que estos genes desempeñen o no un papel en la síntesis local de omocromos en las alas de otras especies, como Heliconius erato, Vanessa cardui y Junonia coenia17,18,20, también está pendiente de pruebas funcionales directas con ambos genes.

Será necesario explorar más a fondo la presencia de genes de síntesis de omocromo funcionalmente redundantes en B. anynana. Tal redundancia funcional podría explicar la falta de fenotipos en las alas, donde el papel del bermellón y el cinabrio podría ser asumido por otros genes. La falta de una expresión clara de kfase en alas WT y de fenotipos mutantes para kfase crispants sugiere que este gen podría no estar funcionando en la síntesis de omochrome en las alas de B. anynana. En estos crujientes, sin embargo, no confirmamos la presencia de indeles. Además, la función de otras enzimas de la ruta, como cardinal, aún no se ha investigado en B. anynana.

Aquí hemos demostrado que los pigmentos omocromos son probablemente parte del anillo naranja en las alas de B. anynana. Se propuso que los omocromos participaran en la coloración del anillo naranja de las manchas oculares en esta especie basándose únicamente en la expresión y los datos funcionales de optix21, un regulador corriente arriba de los omocromos en otras mariposas20. Sin embargo, usando cromatografía de capa fina, hemos identificado una pequeña cantidad de un pigmento, en la región de la escala naranja de las manchas oculares, que coincide (en valor Rf) con el omocromo dihidro-xantomatina. La identidad de estos omocromos también es probablemente distinta de los pigmentos omocromos presentes en las alas de Junonia. Sin embargo, estos omocromos no parecen depositarse en las escamas de las alas en gránulos de pigmento visibles como se observa a través de SEM33 (Fig. S28), como se describe para las células de pigmento omatidiales en los ojos de insectos34. Sin embargo, la identidad molecular precisa de los pigmentos observados mediante TLC necesitará confirmación adicional mediante espectrometría de masas.

En B. anynana, los precursores de omocromo y/o omocromo que se encuentran en las alas pueden sintetizarse en otro órgano, transportarse a través de la hemolinfa y ser absorbidos a través de transportadores de omocromo hacia las escamas naranjas (Fig. 7). Se ha planteado la hipótesis de un mecanismo de transporte similar para el precursor 3-hidroxiquinurina en las alas de las mariposas Heliconius18. Los primeros estudios han demostrado que los metabolitos de la biosíntesis del omocromo pueden secretarse de un tejido a la hemolinfa y ser procesados por otro tipo de tejido. En las larvas de Ephestia kühniella, la actividad de la quinurenina 3-hidroxilasa (cinabrio) se localizó únicamente en los túbulos de Malpighi, mientras que su producto enzimático 3-hidroxiquinurenina se detectó en la hemolinfa de la larva, junto con metabolitos anteriores en la vía del pigmento, como el triptófano y la quinurenina35 (Fig. 7). Los omatidios pupales de esta especie son capaces de absorber la 3-hidroxiquinurenina transportada por la hemolinfa para producir omocromos cuando el metabolito se inyecta en la hemolinfa36. En pupas de mariposa Araschnia levana, se encontró un aumento de 3-hidroxiquinurenina en la hemolinfa a medida que aparecían pigmentos rojos en las escamas de las alas, y la inyección de 3-hidroxiquinurenina radiomarcada reveló que su incorporación en el ala coincidía con la localización espacial de las escamas rojas37. En Papilio xuthus, la quinurenina circula libremente en la hemolinfa durante el desarrollo de la pupa y aumenta su concentración a medida que se inicia la formación del omocromo omatidial, y disminuye bruscamente a medida que aparece el color rojo de las alas38. Estos estudios sugieren que los omocromos que se encuentran en las alas (y los ojos) de estas especies divergentes de polillas y mariposas pueden derivar de la hemolinfa.

Mecanismo de biosíntesis y/o captación de omocromo en las células pigmentarias de omatidios y células de escamas anaranjadas de mariposas Bicyclus anynana. En las células pigmentarias de los omatidios, el transportador de karmoisina propuesto absorbe el triptófano donde, en presencia de las enzimas Vermilion, Kfase y Cinnabar, se convierte en 3-hidroxiquinurenina (3-OHK). El 3-OHK es absorbido dentro del gránulo de pigmento por las proteínas transportadoras White y Scarlet, donde se convierte en xantomatina y dihidro-xantomatina. En las escamas naranjas, el triptófano se convierte en 3-OHK, por un mecanismo desconocido, o se transporta desde la hemolinfa a través de transportadores desconocidos hasta las células de la escama, donde se convierte en xantomatina y dihidro-xantomatina. También proponemos la ausencia de gránulos de pigmento para los omocromos en las células de las escamas. Tenga en cuenta que no hay evidencia directa sobre la participación de la karmoisina en la absorción de triptófano en Drosophila.

Un mecanismo alternativo para explicar la presencia de omocromos en alas que carecen de la expresión de bermellón y cinabrio podría implicar el uso de distintas enzimas en alas y ojos (Fig. 7). En Vanessa cardui, los análisis de expresión génica diferencial realizados en diferentes regiones coloreadas del ala identificaron 26 genes potencialmente involucrados en la pigmentación omocromática. Estos genes incluyen optix, kfase, cinabrio, siete transportadores de la superfamilia de facilitadores principales (MFS), dos proteínas de unión a hormonas juveniles y dos transportadores no clasificados39. En particular, no se encontró que los genes del transportador omocromo blanco y escarlata se expresaran de manera diferencial entre los puntos de tiempo probados y las áreas de diferentes colores de las alas de V. cardui. En Heliconius, también se encontró la expresión de tres nuevos genes transportadores asociados con patrones de alas rojas40. En B. anynana, las eliminaciones de CRISPR de los transportadores omocromos blanco y escarlata tampoco dieron lugar a ningún fenotipo visible en las alas23, lo que sugiere la posibilidad de nuevas enzimas, así como transportadores omocromos presentes en las células de escamas de todas estas especies. Por lo tanto, es posible que, a lo largo de la evolución, se hayan desplegado distintas enzimas y proteínas transportadoras en las alas de B. anynana, en relación con las que se usan en los ojos.

En conclusión, hemos demostrado la implicación de las enzimas de biosíntesis omocromo bermellón y cinabrio en la producción local de pigmentos en los ojos pero no en las alas de las mariposas Bicyclus anynana. Estas enzimas aún podrían estar involucradas en la producción de los pigmentos omocromos que eventualmente se depositan en las áreas anaranjadas de las alas, pero no parecen ser funcionales en las propias células de las alas. Los pigmentos omocromos o los precursores de pigmentos se transportan a las células de las escamas, después de los dos pasos enzimáticos investigados, o se sintetizan in situ a través de nuevas enzimas.

HCR3.0 se realizó con base en los protocolos descritos previamente24. Brevemente, los tejidos del ala y del ojo compuesto en los puntos de tiempo deseados posteriores a la pupa se diseccionaron en una solución de PBS 1X a temperatura ambiente y se fijaron en pocillos de vidrio que contenían formaldehído al 4% en PBS 1X. Después de 30 a 40 min de fijación a temperatura ambiente, los tejidos se lavaron dos veces en PBS 1X durante 3 min y luego dos veces en PBS 1X complementado con Tween 20 al 0,1 % (PBST 1X). La permeabilización se realizó incubando los tejidos durante 30 min en una solución de detergente que contenía SDS al 1,0%, Tween 20 al 0,5%, Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y NaCl 150,0 mM. Las alas de pupa en etapa tardía (> 60 % de desarrollo pupal) con cutículas más gruesas se digirieron en 2,5 μl de proteinasa K en 200 μl de 1X PBST durante 2 min a 55 °C para mejorar la permeabilidad del tejido para la entrada de la sonda. Posteriormente, las alas se colocaron en hielo y la mezcla de digestión se reemplazó con 2 mg/ml de glicina en PBST 1X para detener la reacción. A continuación, los tejidos se lavaron tres veces con PBST 1X y dos veces con SSCT 5X. Los tejidos se incubaron en tampón de hibridación de sonda al 30 % a 37 °C durante 30 min, antes de una incubación más prolongada en tampón de hibridación de sonda al 30 % con sondas primarias 0,02 μM (específicas para bermellón, cinabrio y kfase) a 37 °C durante 16 h . Los tejidos se lavaron cuatro veces en tampón de lavado de sonda al 30 % en intervalos de 15 min a 37 °C y se lavaron dos veces con 5X SSCT a temperatura ambiente. Los tejidos se incubaron en tampón de amplificación durante 30 min a temperatura ambiente y posteriormente en tampón de amplificación con sondas fluorescentes secundarias en la oscuridad a temperatura ambiente durante 12 h. Luego, los tejidos se lavaron en 5X SSCT cuatro veces en intervalos de 20 min, se incubaron con DAPI diluido en 5X SSCT durante 5 min y se lavaron dos veces con 5X SSCT. Los tejidos se montaron en un portaobjetos de vidrio en tampón de montaje y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Olympus FV3000.

La edición de genes CRISPR-Cas9 para bermellón, cinabrio y quinurenina formamidasa se realizó de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente41 con los siguientes ajustes menores. Para todos los genes, se diseñaron ARN guía sintéticos (ARNcr) (secuencias en Archivo complementario) utilizando la herramienta de diseño de guía personalizada IDT. Una solución que comprende tampón dúplex, tampón Cas9 y mezclas equimolares de crRNA y Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA se incubó a 95 °C durante 5 min y se enfrió a temperatura ambiente antes de agregar la nucleasa Cas9.

Confirmamos la presencia de mutaciones bermellón y cinabrio tanto en tejidos pupales como adultos. Los tejidos del ala de la pupa se diseccionaron de individuos con un desarrollo pupal del 25 al 28% (40–44 h) o del 44 al 47% (70–74 h). El ADN se extrajo y purificó con el kit Omega Bio-tek EZNA Tissue DNA (SKU: D3396-01). En crocantes adultos, se aislaron los tejidos de los ojos y las alas y ambos tipos de tejidos se procesaron por separado utilizando las técnicas de extracción de ADN mencionadas anteriormente. La secuenciación de extremos emparejados se realizó en bibliotecas de secuenciación que comprenden la región de interés amplificada y la presencia de INDEL se verificó con Geneious v10.1.3.

La extracción de pigmentos de las secciones del ala se realizó siguiendo un protocolo previamente definido5,17. Las regiones de escamas anaranjadas de las alas se aislaron del ala adulta de B. anynana, J. almana y J. orythia utilizando tijeras finas (Fig. 6). Los tejidos de las alas diseccionadas se homogeneizaron en metanol acidificado (HCl al 0,5 %) utilizando perlas de circonio de 0,01 mm en un homogeneizador (Next Advance Bullet Blender). El homogeneizado se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 min y el sobrenadante se desecó en una centrífuga de vacío (ThermoScientific) durante 30 min y se reconstituyó en 20 µl de metanol. Las mezclas de pigmentos, así como los colorantes de referencia amaranto y azul de bromofenol, se colocaron en una placa de gel de sílice (F254, Merck) y se corrieron con fenol (SigmaAldrich) como solvente de desarrollo. Los valores del factor de retención (Rf) se calcularon como la relación entre la distancia de migración del compuesto de pigmento y la del frente del solvente medido en ImageJ.

Tras la crianza hasta el 61,5 % de desarrollo pupal, se extrajo hemolinfa pupal de individuos de B. anynana de tipo salvaje. Los pigmentos omocromos se extrajeron de hemolinfa pupal usando metanol frío siguiendo un protocolo previamente definido18 y se diluyeron en metanol absoluto. Las muestras de pigmentos de hemolinfa se transfirieron a cubetas de 1,5 ml y los espectros de absorbancia se adquirieron utilizando un espectrofotómetro de barrido visible/UV Shimadzu UV-1800. Los datos espectrales se analizaron utilizando Shimadzu UVProbe y R Software.

Los adultos se congelaron durante un día a -20 °C. Las alas de mariposa se quitaron con un par de tijeras finas y se tomaron imágenes con un microscopio Leica DMS1000. Para obtener imágenes de los ojos de adultos, los adultos se congelaron durante 40 minutos a -20 °C para minimizar el alcance de los cambios de color de ojos compuestos post mortem antes de la obtención de imágenes.

El tejido del ala de la pupa se diseccionó de individuos de tipo salvaje con PD al 15 % (24 h) y se almacenó en solución de estabilización Invitrogen™ RNAlater™. El ARN total se extrajo y se purificó utilizando el kit Qiagen RNeasy Plus Micro (Cat No. 74034). El ADN complementario se sintetizó utilizando Invitrogen™ SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Cat No. 18064014) y se diluyó a 50 ng/μL. La PCR se realizó en el ADNc usando cebadores específicos para los genes de interés y el gen de referencia ef1α (Tabla S4) usando 2x PCRBIO Taq Mix Red (n.º de cat.: PB10.11-20) durante 32 ciclos. Los productos de PCR se procesaron en un gel de agarosa al 1 % y se tomaron imágenes en un sistema de documentación de gel (Azure 200 Gel Imaging System: AZI200).

Se usó una aguja fina de metal para extraer las escamas de las alas adultas de WT. Luego, las escalas se montaron en una cinta de carbono fijada a un trozo de SEM, se recubrieron con platino usando JEOL JFC-1600 Auto Fine Coater y se tomaron imágenes bajo un SEM de emisión de campo JEOL JSM-6701F.

Los conjuntos de datos analizados en el estudio actual están disponibles en el depósito del NCBI. Todas las secuencias utilizadas junto con sus ID de genes y enlace directo se mencionan en el archivo complementario.

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Nos gustaría agradecer a CBIS, NUS por acceder al microscopio confocal fv3000, al profesor asociado Leong Weng Kee y a Teresa Lim por su ayuda y acceso al espectrofotómetro UV-Visible, a Lee Ka Yau (instalación SEM, Departamento de Química, NUS) por su ayuda con la obtención de imágenes de las muestras SEM, y Suriya Narayanan Murugesan por proporcionar mariposas adultas Junonia almana y Junonia coenia. También nos gustaría agradecer al profesor Robert D. Reed por su invaluable perspicacia al interpretar nuestros hallazgos.

Este trabajo fue apoyado por una Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Singapur, bajo su programa de Investigador (Premio NRF-NRFI05-2019-0006) y el Programa de Investigación Competitiva de NRF (Premio NRF-CRP20-2017-0001).

Estos autores contribuyeron por igual: How Hong Chuen Shaun y Tirtha Das Banerjee.

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, 117557, Singapur

Cómo Hong Chuen Shaun, Tirtha Das Banerjee y Antόnia Monteiro

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Redacción—borrador original: HHCS, TDB; Redacción—revisión y edición: HHCS, TDB, AM; Conceptualización: TDB, AM; Metodología e investigación: HHCS, TDB; Validación: HHCS, TDB; Análisis formal: HHCS, TDB; Recursos: AM; Curación de datos: HHCS, TDB; Visualización: HHCS, TDB; Supervisión: TDB, AM; Administración del proyecto: AM; Adquisición de fondos: AM

Correspondencia a Tirtha Das Banerjee o Antόnia Monteiro.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Shaun, HHC, Banerjee, TD & Monteiro, A. El bermellón y el cinabrio están involucrados en la biosíntesis del pigmento omocromo en los ojos pero no en las alas de las mariposas Bicyclus anynana. Informe científico 13, 9368 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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Recibido: 13 febrero 2023

Aceptado: 05 junio 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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