Respuestas preferenciales de anticuerpos de conejo a C

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9156 (2023) Citar este artículo

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Los anticuerpos generados en conejos inmunizados con péptidos se han utilizado en investigación biológica durante décadas. Aunque ha habido una amplia implementación de este enfoque, en ocasiones es difícil atacar proteínas específicas por múltiples razones. Una consideración que se observó en ratones es que las respuestas humorales pueden dirigirse preferentemente al extremo carboxilo de la secuencia peptídica que no está presente en la proteína intacta. Para arrojar luz sobre la frecuencia de las respuestas preferenciales de anticuerpos de conejo a C-terminal de inmunógenos peptídicos, presentamos nuestra experiencia con la generación de anticuerpos de conejo contra NOTCH3 humano. Se generaron un total de 23 anticuerpos contra 10 secuencias peptídicas de NOTCH3 humano. Se determinó que más del 70 % (16 de 23) de estos anticuerpos policlonales eran de preferencia C-terminal: los anticuerpos reactivos con el péptido NOTCH3 apuntaban en gran medida al grupo carboxilo libre terminal del péptido inmunizante. Los anticuerpos que preferían los epítopos C-terminales reaccionaron débilmente o no reaccionaron en absoluto con las secuencias diana recombinantes con extensión del C-terminal que eliminó el grupo carboxilo libre de la estructura del inmunógeno; además, cada uno de estos antisueros no reveló reactividad de anticuerpos frente a proteínas truncadas antes del extremo C-terminal del inmunógeno. En aplicaciones inmunocitoquímicas de estos anticuerpos antipéptido, encontramos de manera similar reactividad a objetivos recombinantes que se unen mejor a células que expresan el extremo C libre de la secuencia inmunizante. En conjunto, nuestra experiencia demuestra una fuerte propensión de los conejos a generar respuestas de anticuerpos a los epítopos C-terminales de los péptidos derivados de NOTCH3, lo que se prevé que limite su uso contra la proteína nativa. Discutimos algunos enfoques potenciales para superar este sesgo que podría mejorar la eficiencia de la generación de anticuerpos en este paradigma experimental comúnmente utilizado.

El desarrollo y la aplicación de anticuerpos de investigación ha sido indispensable para el estudio de las proteínas. Entre los anticuerpos de investigación, los antisueros antipéptidos se han ganado un favor significativo, en gran parte debido a la elucidación de un gran número de secuencias genéticas que codifican proteínas y a los avances tecnológicos en la síntesis de péptidos. Estos avances permiten producir antisueros, normalmente sin dificultad, inmunizando animales sin necesidad de producir o purificar proteínas dianas1,2.

Aunque en gran parte exitosa, la inmunización antipéptido a veces no genera anticuerpos útiles para la detección de proteínas dianas1,3. Los fallos se han atribuido a la incapacidad del antígeno peptídico para adoptar la misma conformación que la proteína diana4, ocultando la secuencia diana en regiones inaccesibles5, o a la modificación postraduccional de la proteína diana que no se refleja en el inmunógeno peptídico.

En un estudio anterior, Liang y sus colegas6 observaron otra razón potencial por la que no se generaron anticuerpos antipéptido utilizables: el direccionamiento preferencial de los anticuerpos al extremo carboxilo (terminal C) de los péptidos inmunizantes que no está presente en la proteína intacta. Informaron que la inmunización de ratones con un epítopo interno de C-CAM1 produjo una respuesta de anticuerpos en gran parte al extremo C-terminal del péptido inmunizante; Los anticuerpos monoclonales de los ratones reaccionaron frente al péptido inmunizante de una manera dependiente del extremo C-terminal del inmunógeno, pero estos anticuerpos no se unieron a la proteína intacta. Los investigadores concluyeron que los anticuerpos monoclonales derivados de ratones requerían el resto carboxilato presente en el extremo C-terminal que fue eliminado por el enlace peptídico presente en la proteína intacta.

En otro estudio, Edwards y colegas7 desarrollaron un enfoque exitoso para generar anticuerpos contra las proteínas bacterianas que se basó en la inmunización de conejos con pequeños péptidos correspondientes a los extremos C de las proteínas individuales. Este estudio indicó que los conejos eran capaces de generar respuestas efectivas a los extremos C de los péptidos y que los antisueros generados a los inmunógenos cortos eran notablemente específicos. La proporción relativa de anticuerpos que prefirieron el extremo C-terminal de los inmunógenos peptídicos fue alta para varios anticuerpos notificados, según lo evaluado por la competencia peptídica de los ensayos ELISA.

En el estudio actual, consultamos: (1) el grado en que las respuestas humorales antipéptido se dirigen preferentemente al extremo C de las secuencias peptídicas humanas inmunizantes en conejos individuales y (2) la frecuencia de las respuestas humorales preferidas del extremo C en una serie de conejos inmunizados con péptidos que representan fragmentos de una proteína humana. Para abordar estas preguntas, analizamos retrospectivamente antisueros policlonales de una serie de proyectos cuyo objetivo era generar anticuerpos NOTCH3, centrándonos en la especificidad de cada preparación de anticuerpos para el extremo C del péptido utilizado para la inmunización.

NOTCH3 es un receptor transmembrana (Fig. 1A) que desempeña múltiples funciones en el desarrollo, la homeostasis y la patología. Las mutaciones en NOTCH3 son responsables de la causa más común de accidente cerebrovascular hereditario y demencia vascular, la arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL)8,9.

Generación y caracterización de anticuerpos anti-péptido contra NOTCH3. (A) Posiciones de secuencias NOTCH3 dirigidas a la producción de anticuerpos e inmunógenos peptídicos. La parte superior muestra una representación esquemática de la proteína NOTCH3 humana, compuesta en gran parte por repeticiones similares a EGF en tándem en el extremo N-terminal. Los círculos representan las posiciones de las secuencias peptídicas utilizadas para la inmunización de conejos. Las secuencias peptídicas correspondientes, las ubicaciones repetidas de EGF (EGF#) y los números de anticuerpos se muestran a continuación. Se utilizaron secuencias de tipo salvaje, con la excepción de dos péptidos (correspondientes a los anticuerpos 2076–2079) que incluyen residuos mutantes de CADASIL (en rojo). (B) Estrategia de caracterización para determinar las preferencias de destino antisueros. La explicación detallada de la caracterización de los anticuerpos 1495 y 1496 contra una secuencia peptídica de EGF27 ejemplifica el enfoque empleado para determinar la especificidad de secuencia de todos los anticuerpos. La secuencia del inmunógeno (verde) se clonó en el extremo C de EGFP (GFP) para dirigir la expresión de 5 variantes recombinantes. El clon 0 termina precisamente en el extremo C del inmunógeno. El Clon − 2 es una deleción de dos aminoácidos del Clon 0; El Clon − 1 es una deleción de un aminoácido del Clon 0; El Clon + 1 contiene una extensión de aminoácidos al Clon 0 (de la secuencia de tipo salvaje); y el Clon + 2 contiene dos aminoácidos añadidos al Clon 0). Los 5 recombinantes y un clon de EGFP sin ninguna secuencia de NOTCH3 se expresaron en células HEK293 y las proteínas recombinantes se analizaron mediante inmunotransferencia (IB; véanse las Figs. 2, 3) y mediante inmunocitoquímica (ICC; véase la Fig. 5) utilizando los anticuerpos correspondientes.

En el curso de nuestro trabajo en NOTCH3, descubrimos que NOTCH3 se escinde en dos secuencias Asp-Pro cerca del extremo N, que se mejora en CADASIL10,11. Estos hallazgos requerían la generación de anticuerpos monoclonales específicos de neoepítopo que fueran específicos para los residuos de ácido aspártico C-terminal que se generan mediante la escisión de Asp-Pro. Estos anticuerpos son específicos para secuencias con ácido aspártico C-terminal; la extensión de la proteína más allá de los residuos terminales de aspartato eliminó la unión10,11.

También observamos durante estos estudios que los sueros policlonales de conejos inmunizados que se usaron para generar los anticuerpos contra las secuencias de aspartato terminal estaban muy enriquecidos en anticuerpos que requerían el aspartato C-terminal; los sueros contenían solo pequeñas cantidades de anticuerpos capaces de reaccionar con secuencias que no contenían el residuo de aspartato C-terminal. (Los datos se muestran como parte de este estudio). Esto nos llevó a realizar el estudio actual para determinar la frecuencia de las respuestas de anticuerpos que reconocen preferentemente las secuencias C-terminales de una gran serie de anticuerpos NOTCH3 independientes que se prepararon mediante la inmunización con péptidos de conejos. .

Las regiones de NOTCH3 a las que nos hemos dirigido para la producción de anticuerpos se muestran en la Fig. 1A. Todos los anticuerpos se dirigen al ectodominio de la proteína, la región que es el sitio de la mayoría de las mutaciones de CADASIL y que está compuesta por repeticiones similares a EGF en tándem12,13. Las repeticiones similares a EGF están enriquecidas en residuos de cisteína y todos los péptidos incluyen al menos un residuo de cisteína. Las secuencias de los péptidos utilizados se muestran en la Fig. 1B. Se usaron péptidos para inmunizar de 2 a 4 conejos a la vez. Diferentes proveedores realizaron los experimentos10,11,14 y las inmunizaciones se realizaron utilizando péptidos conjugados con KLH cuya pureza se verificó mediante espectroscopia de masas.

Los conejos se inmunizaron de acuerdo con programas estandarizados por el proveedor contratado para fabricar los anticuerpos. En todos los casos, los sueros preinmunes exhibieron una reactividad mínima a los inmunógenos y al final del programa de inmunización, cada animal produjo suero positivo por ELISA a una dilución superior a 1:512,000, lo que indica una fuerte respuesta humoral a la inmunización.

Los sueros se purificaron por afinidad usando columnas generadas por entrecruzamiento del péptido con perlas. Se utilizaron métodos estándar, incluido el lavado con medios y la elución con tampón ácido que luego se dializó frente a PBS neutral antes de que las preparaciones de anticuerpos se congelaran después de la estabilización con glicerol al 20%. La reactividad de las preparaciones de anticuerpos policlonales finales se verificó por ELISA.

La especificidad de cada secuencia diana del anticuerpo NOTCH3 se determinó sondando inmunotransferencias de GFP recombinante fusionadas con secuencias peptídicas de diferentes longitudes; ilustramos la estrategia en un ejemplo que se muestra en la Fig. 1B. Los clones genéticos de GFP se fusionaron con secuencias de ADN que codifican la secuencia de aminoácidos de cada péptido inmunizante (llamado Clon 0 para cada anticuerpo). Se eliminaron uno o dos aminoácidos del péptido objetivo para generar los Clones - 1 y - 2. Además, se agregaron uno o dos aminoácidos de la secuencia de la proteína NOTCH3 para generar los Clones + 1 y + 2. Un ejemplo de clones GFP generados para probar los objetivos de secuencia de los anticuerpos 1495 y 1496 se muestra en la Fig. 1B. Los clones de expresión de ADNc - 2, - 1, 0, + 1 y + 2 se transfectaron en células para generar lisados de proteínas que contenían proteínas GFP de fusión y se separaron en transferencias Western. Las transferencias se probaron con antisuero NOTCH3 y anticuerpos GFP. Posteriormente, la proporción de la señal del anticuerpo NOTCH3 a GFP se tomó como una medida de la afinidad del anticuerpo NOTCH3. Si los anticuerpos reaccionan preferentemente contra el extremo C del péptido inmunizante, se observará la señal de unión más alta a la proteína de fusión GFP del clon 0, con señales más bajas para las proteínas de fusión GFP de los clones − 2, − 1, + 1 y + 2.

El análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos NOTCH3 se muestra en las Figs. 2, 3 y Figs. Suplementarias. 1, 2. Una gran fracción de los anticuerpos reaccionó a las proteínas que contienen el extremo carboxilo del péptido inmunizante, con una cantidad mucho menor de anticuerpos que se unen a las proteínas a las que les falta el residuo carboxilo (clones - 2 y - 1) y a las proteínas con amino extensiones ácidas que bloquean el residuo carboxilo del péptido (clones + 1 y + 2).

Análisis de inmunotransferencia de la preferencia de diana de los anticuerpos antipéptido NOTCH3. Se muestran análisis de inmunotransferencia de lisados de proteínas de células transfectadas con fusiones GFP con residuos C-terminales variables (A–K). Para cada una de estas transferencias, HEK293 se transfectó con 6 plásmidos que dirigen la expresión de EGFP sin secuencias NOTCH3 (GFP) o con una secuencia de inmunógeno completa (Clon 0) o deleciones (-2 y -1) o adiciones (+ 1 o + 2) (consulte la Fig. 1B) que se corresponden con el anticuerpo enumerado (consulte el número de anticuerpo junto a la transferencia inferior de cada panel). Las secuencias utilizadas para la inmunización están codificadas con círculos correspondientes a la Fig. 1A. Las transferencias se probaron tanto para GFP (transferencia superior) como para anticuerpos NOTCH3 (transferencia inferior) y se determinó la proporción de señal inferior/superior. Todos los valores se normalizaron a GFP. Se usaron dos controles GFP diferentes que contenían extensiones C-terminales no NOTCH3 de diferentes tamaños. (L) Una representación esquemática de proteínas producidas por transfección que muestra que para cada secuencia objetivo, el Clon 0 contiene el inmunógeno utilizado (que termina en un residuo representado por el diamante rojo), mientras que otros clones contienen deleciones o extensiones (diamantes morados y azules). El clon 0 en cada panel genera la mayor cantidad de señal si un anticuerpo se dirige preferentemente al extremo C del inmunógeno. Los experimentos de inmunotransferencia se realizaron al menos tres veces para cada anticuerpo. La significancia con p < 0,05 en comparación con el Clon 0 se indica mediante un asterisco negro (ANOVA unidireccional para datos normales) y un asterisco rojo (prueba de Kruskal-Wallis para datos no paramétricos). Los geles de longitud completa se muestran en las Figs. complementarias. 3, 4.

Análisis de inmunotransferencia adicional de la preferencia de diana de los anticuerpos antipéptido NOTCH3. Consulte la Fig. 2; se evaluaron anticuerpos adicionales de la misma manera en (A–L). Como antes, los experimentos se realizaron al menos tres veces para cada anticuerpo. Los geles de longitud completa se muestran en las Figs. complementarias. 3, 4. La significación con p < 0,05 en comparación con el Clon 0 se indica mediante un asterisco negro (ANOVA unidireccional para datos normales) y un asterisco rojo (prueba de Kruskal-Wallis para datos no paramétricos).

Cabe destacar que hubo una concordancia muy fuerte de la preferencia específica del extremo C-terminal entre los anticuerpos que se produjeron después de la inmunización con una secuencia peptídica dada. Las secuencias que generaron preferencias C-terminales lo hicieron en el 100% de los conejos inmunizados; en el caso de EGF2C, los 6 conejos demostraron cualitativamente respuestas humorales dirigidas a epítopos C-terminales (Figs. 2H–K y 3A,B). Los péptidos que generaron anticuerpos con preferencia C-terminal atenuada generaron preferencias similares en cada conejo analizado (por ejemplo, EGF1N (Fig. 2A, B) y EGF13 (Fig. 3E, F)). La concordancia de la preferencia C-terminal es coherente con la conservación de las respuestas humorales entre individuos que depende de la secuencia peptídica utilizada para la inmunización.

Un gran número de los péptidos utilizados para generar anticuerpos terminaron en residuos de aspartato. Para verificar que los anticuerpos requerían residuos únicos además del aspartato terminal, realizamos inmunotransferencias en todas las proteínas del clon 0 que terminaron en ácido aspártico usando anticuerpos dirigidos contra las secuencias de ácido aspártico C-terminal. Aunque algunos anticuerpos tuvieron una reactividad cruzada muy débil contra epítopos que no se usaron para la inmunización, nueve de nueve anticuerpos fueron más ávidos de secuencias NOTCH3 usadas para la inmunización cuando se probaron contra paneles de fusiones GFP-NOTCH3. La Figura 4 ilustra cuatro anticuerpos que eran altamente específicos para la secuencia inmunizante en inmunotransferencias.

Especificidad de los anticuerpos que se dirigen preferentemente al extremo C de los péptidos NOTCH3. Se realizó un análisis de inmunotransferencia utilizando los anticuerpos policlonales 5210 (A), 4944 (B), 1415 (C) y 1496 (D) para determinar la especificidad de cada anticuerpo frente a nueve secuencias NOTCH3 independientes. La identidad de cada proteína se muestra encima de los carriles de las transferencias; el carril 1 es un control negativo de GFP que no es NOTCH3; otros carriles representan el Clon 0 de las secuencias que se muestran en la Fig. 1 (las marcas se han abreviado para mayor claridad; véase la Fig. 1A, EGF#). Cada panel muestra el sondeo de GFP (transferencia superior) en comparación con el sondeo con los anticuerpos NOTCH3 (transferencia inferior de cada par). Los geles de longitud completa se muestran en la Fig. 5 complementaria.

También evaluamos la preferencia C-terminal de los anticuerpos NOTCH3 mediante tinción celular para proteínas expresadas en cultivo celular. Los cultivos celulares se transfectaron con construcciones de expresión utilizadas en las Figs. 2, 3. Después de fijar las células transfectadas, realizamos inmunocitoquímica utilizando anticuerpos afines. Se esperaba que los anticuerpos con preferencia C-terminal mostraran una fuerte tinción de las células transfectadas con el clon 0 pero no con los clones - 2, - 1, + 1 o + 2. En general, hubo una buena correspondencia entre la preferencia C-terminal evaluada por inmunotransferencia y Preferencia C-terminal evaluada por inmunocitoquímica. Por ejemplo, en la Fig. 5, mostramos la tinción con anticuerpos 4143, 9932 y 1415 de células transfectadas con una serie de clones que contienen su péptido objetivo (clon 0; Fig. 5) y deleciones o adiciones (clones − 1 y + 1; Figura 5). La tinción celular fue más fuerte con el Clon 0 y no estuvo presente por encima del fondo para los Clones − 1 o + 1. Este patrón coincide con las preferencias de reactividad por inmunotransferencia Hubo varios anticuerpos que generaron una alta tinción de fondo tanto para las células no transfectadas como para todos los grupos transfectados, lo que hizo imposible evaluar la preferencia C-terminal. El anticuerpo 8274 mostró tinción para células que expresaban Clones - 1, 0 y + 1 (fila 5; Fig. 5) que coincidían con los resultados de inmunotransferencia que mostraban que este anticuerpo mostraba una unión C-terminal no exclusiva.

Preferencias de sitio de anticuerpos anti-péptido NOTCH3 por análisis inmunocitoquímico. Las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con construcciones recombinantes correspondientes a las etiquetas principales. Cada conjunto de células transfectadas se tiñó con anticuerpos a la izquierda. GFP-Clone − 1 corresponde a GFP fusionado con la correspondiente secuencia peptídica inmunizante con una eliminación de un aminoácido. GFP-Clone 0 es la fusión de GFP con la secuencia del inmunógeno (emparejado en el extremo C-terminal con la secuencia del péptido en la Fig. 1A). GFP-Clone + 1 contiene un aminoácido extra. Todos los recombinantes de GFP con secuencias de NOTCH3 incluyen secuencias utilizadas para la inmunización (como se muestra en la Fig. 1A). Por ejemplo, las células sondeadas con 4143 se transfectaron con construcciones que terminan en secuencias de EGF2(C): SCRCPRGFRGPDCSLP, SCRCPRGFRGPDCSLPD y SCRCPRGFRGPDCSLPDP.

El trabajo anterior mostró que el sesgo hacia las respuestas inmunitarias humorales en ratones al extremo C-terminal de los péptidos podría limitar la diversidad y la utilidad de los anticuerpos6. Aquí describimos los resultados de una serie de 23 inmunizaciones de conejos con 10 péptidos diferentes. Demostramos que una gran mayoría de los antisueros de estas inmunizaciones generan anticuerpos que reaccionaron principalmente a las secuencias C-terminales del péptido a expensas de los anticuerpos que son independientes del C-terminal del inmunógeno. También mostramos que la preferencia del epítopo C-terminal es similar entre conejos individuales y depende de la secuencia peptídica.

Este es el estudio más grande hasta donde sabemos que demuestra una fuerte preferencia por la respuesta humoral en conejos para apuntar a los extremos C de las secuencias peptídicas humanas. Los resultados son consistentes con el estudio de Edwards que informó una tasa muy efectiva de producción de anticuerpos dirigidos a una clase de proteínas de interés cuando se usaron secuencias de péptidos C-terminales para la inmunización7. Los anticuerpos policlonales anteriores generados contra péptidos que terminan en aspartato estaban compuestos principalmente de anticuerpos que reaccionan contra los extremos C de los inmunógenos peptídicos, lo que permite la detección de neoepítopos generados por caspasa15,16. Parece probable, según el trabajo colectivo, que un enfoque para generar reactivos contra las proteínas de los mamíferos podría utilizar un sesgo para que el sistema inmunitario de los conejos genere anticuerpos C-terminales.

Un aumento en la cantidad de anticuerpos monoclonales de conejo, impulsado por la disponibilidad de flujos de trabajo rápidos que facilitan la generación de anticuerpos, incluidas las tecnologías de clonación de células B, subraya la importancia de estas observaciones. El número de clones necesarios para examinar para generar anticuerpos exitosos podría ser alto si los péptidos utilizados para la inoculación provocan respuestas específicas de C-terminal. Es posible que los futuros proyectos monoclonales de conejo puedan aumentar su eficacia mediante la generación de anticuerpos contra el extremo C nativo de las proteínas, como sugieren Edwards et al.7.

¿Se pueden generalizar los hallazgos? Un factor que nos da confianza es que examinamos múltiples secuencias peptídicas como inmunógenos. Además, el estudio no se basó en el uso de una sola instalación para producir anticuerpos; la generación de anticuerpos se subcontrató a partes que no estaban involucradas en el análisis de los sueros. Además, el proyecto se llevó a cabo durante un largo período de tiempo. Finalmente, pudimos confirmar la preferencia C-terminal de los anticuerpos utilizando dos métodos diferentes en la mayoría de los casos.

Sin embargo, es posible que la preferencia observada por C-terminal esté sobreestimada. Una limitación de este informe es su naturaleza retrospectiva que analizó sueros que se obtuvieron como parte de múltiples proyectos independientes no diseñados para probar la hipótesis de este informe. Todos los péptidos utilizados en este estudio se derivaron de una sola proteína extracelular. NOTCH3 puede ser menos inmunogénica que otras proteínas porque puede estar circulando de forma natural17 y porque los homólogos de mamíferos están bien conservados. De hecho, la mayoría de los péptidos humanos utilizados para la inmunización son casi idénticos a las secuencias de conejo. Hay diferencias de un solo residuo en los péptidos utilizados para los anticuerpos 2076–2079, 9931, 9932, 1412 y 1413 y dos diferencias de aminoácidos para los anticuerpos 1495–1496. La mitad restante de los péptidos humanos son idénticas a las secuencias de conejo.

Como investigación pragmática, no realizamos análisis mutacionales ni modificaciones bioquímicas de péptidos que permitirían detalles más finos de la preferencia C-terminal. Las secuencias elegidas para este estudio no estaban libres de cisteína, ya que NOTCH3 es una proteína rica en cisteína. No podemos descartar la posibilidad de que la preferencia C-terminal esté impulsada por el alto contenido de cisteína de los péptidos que pueden forzar a las proteínas a conformaciones específicas que sesgan la respuesta humoral. Se podrían considerar estudios futuros con un examen ampliado de los títulos C-terminal, particularmente si son iniciados por múltiples investigadores o fabricantes de anticuerpos a escala industrial que probablemente produzcan datos en una escala mucho mayor que este estudio. Tal base de datos permitiría una comprensión más profunda de categorías específicas de secuencias que tienen más probabilidades de generar reactividad C-terminal.

Independientemente de la generalización, está claro que se produce una preferencia C-terminal de respuestas de anticuerpos en conejos; de acuerdo, la disminución de la cantidad relativa de anticuerpos C-terminales puede mejorar la eficacia de la generación de anticuerpos. En el futuro, se pueden probar varios métodos para bloquear el extremo C, incluido (1) el uso de péptidos cíclicos; (2) bloqueo químico del extremo C-terminal de péptidos por esterificación; (3) purificación por afinidad utilizando péptidos conjugados a través del extremo C terminal o con extremos C bloqueados; (4) estrategias para prevenir la reactividad de los residuos de cisteína que pueden ocultar regiones inmunogénicas importantes para el reconocimiento de la mitad de los péptidos; y (5) uso de adyuvantes alternativos o dosis agresivas de adyuvantes que podrían ayudar a superar la tolerancia a los epítopos conservados en el núcleo de los péptidos. Cabe señalar que Liang et al.6 han amidado el extremo C de las secuencias de C-CAM1 y no encontraron que aumentara la tendencia de los ratones a producir anticuerpos que reconocieran la proteína diana intacta; en cambio, sugirieron la detección de anticuerpos monoclonales contra un péptido extendido en el extremo C más largo como un inmunógeno, seguido del uso de un péptido corto para la detección (o en este caso, la purificación por afinidad). Con respecto a la alquilación de cisteína para bloquear los péptidos ricos en cisteína del entrecruzamiento químico, esto podría intentarse pero se ha demostrado que sus efectos se atenúan porque las cisteínas alquiladas pueden convertirse en el objetivo de las respuestas de anticuerpos18,19. Un punto de partida natural para probar el efecto de los adyuvantes sería usar alternativas al adyuvante completo de Freund, que se usó para todos los animales en este estudio.

Llegamos a la conclusión de que la preferencia C-terminal de las respuestas de anticuerpos puede ser una característica común de la producción de anticuerpos antipéptido; esto debe considerarse como una posible causa de la falla en la generación de anticuerpos contra las proteínas diana nativas.

Los proveedores comerciales generaron anticuerpos policlonales de conejo utilizando procedimientos estándar que se detallan en otro lugar10,11,14. Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de GenScript y Cocalico Biologics) y se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, incluidas las recomendaciones del Panel sobre Eutanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y ARRIVE directrices (no se incluyó un grupo de control de animales inmunizados sin péptidos, ya que no se requiere para la producción de anticuerpos). Los antígenos peptídicos se sintetizaron correspondientes a los residuos de la proteína NOTCH3 humana que se muestra en la Fig. 1 (secuencias de Acceso: NP_000426.2 GI: 134244285). Los antígenos se entrecruzaron con KLH antes de la inmunización, que se realizó con adyuvante de Freund completo para la inmunización primaria y con Freund incompleto para refuerzos posteriores. Todos los animales a los que se les inyectaron los antígenos peptídicos descritos se incluyeron en el estudio. Los proveedores analizaron las pruebas de sangrado de acuerdo con su flujo de trabajo estandarizado. Se utilizó suero de hemorragias terminales para evaluar los perfiles de reactividad en el presente estudio.

Se insertaron oligonucleótidos de doble cadena que codifican epítopos diana en el extremo C-terminal del marco de lectura abierto de EGFP mediante procedimientos de unión estándar con pEGFP-C3 (Clontech); todas las construcciones se secuenciaron para validar la presencia de un marco de lectura abierto continuo. Como controles, se usaron EGFP-C1 o EGFP con una extensión C-terminal irrelevante para medir la reactividad de fondo a la proteína EGFP. El uso de dos controles negativos generó productos de diferentes tamaños, vistos en diferentes paneles de inmunotransferencia (por ejemplo, Fig. 2A–H frente a Fig. 2I,K).

Empleamos métodos del trabajo descrito anteriormente14,18. Las proteínas se resolvieron en geles de poliacrilamida SDS; luego se transfirieron a nitrocelulosa con un instrumento iBlot 2 (Invitrogen, método P0 20 V por 1 min/23 V por 4 min/25 V por 2 min); Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon usando TBST con leche al 5 % y posteriormente se probaron con anticuerpos primarios en TBST durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios se usaron a una dilución 1:1000 de sueros purificados por afinidad. Los anticuerpos secundarios en TBST se aplicaron a temperatura ambiente durante 30 min. El lavado después de las incubaciones de anticuerpos se realizó tres veces usando TBST a temperatura ambiente. Las preparaciones de anticuerpos secundarios utilizadas incluyeron burro anti-ratón IRDye 680RD (Li-Cor #926-68072, dilución 1:10,000, AB_10953628) y cabra anti-conejo IRDye 800CW (Li-Cor #926-32211, dilución 1:10,000, AB_2651127) . Se empleó un Li-Cor Odyssey Imager con configuraciones de detección a 700 nm y 800 nm y el software Li-Core Image Studio para la captura y cuantificación de datos. Las inmunotransferencias de longitud completa se muestran en las Figs. complementarias. 3–5.

Las células HEK293 cultivadas se cultivaron en DMEM y suero bovino fetal al 10%. Se realizó inmunocitoquímica en estas células después de transfectarlas con plásmidos EGFP usando PolyJet (SignaGen, cat# SL100688) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante20. Después de la incubación durante la noche, las células se fijaron con formalina. Las células se incubaron en una solución de bloqueo (BSA al 2 % en PBS) durante 30 minutos y se aplicó el anticuerpo primario (1:200 para anticuerpos GFP y 1:500 para sueros purificados por afinidad) durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente. Se aplicaron anticuerpos secundarios biotinilados en solución de bloqueo a una dilución de 1:200 durante 30 min seguidos de 15 min de incubación de solución ABC preparada de acuerdo con el protocolo del fabricante (kit Vectastain Elite ABC, Vector Lab, n.° de catálogo NC9293436). Finalmente, se aplicó la incubación DAB para la reacción de color durante 1 a 5 minutos con el kit de sustrato ImmPACT DAB HRP (Vector Lab, n.º de cat. NC9567138); todos los pasos de lavado se realizaron con PBS, de tres a cinco veces; las células no se contratiñeron. Las transfecciones replicadas también se tiñeron para GFP (sc-9996, Santa Cruz Biotechnology).

Se analizó la normalidad de los conjuntos de datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Para los datos normalmente distribuidos, las comparaciones se realizaron utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de Dunnet para comparaciones múltiples. Para el análisis no paramétrico, se utilizaron las pruebas de Kruskal-Wallis seguidas del análisis post hoc de comparación múltiple de Dunn para comparar las diferencias entre los grupos (software de análisis Prism 8). Un valor de probabilidad < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Departamento de Neurología, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, EE. UU.

Soo Jung Lee, Mitchell B. Gasche, Connor J. Burrows, Akhil Kondepudi, Xiaojie Zhang y Michael M. Wang

Departamento de Fisiología Molecular e Integrativa, Universidad de Michigan, 7725 Medical Science Building II Box 5622, 1137 Catherine St., Ann Arbor, MI, 48109-5622, EE. UU.

Michael M Wang

Servicio de Neurología, Departamento de Asuntos de Veteranos, VA Ann Arbor Healthcare System, Ann Arbor, MI, 48105, EE. UU.

Soo Jung Lee, Xiaojie Zhang y Michael M. Wang

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SJL diseñó el estudio, realizó experimentos, analizó los datos, preparó las cifras, revisó el manuscrito. MBG realizó experimentos, analizó los datos, preparó las figuras, revisó el manuscrito. CJB realizó experimentos, revisó el manuscrito. AK realizó experimentos, revisó el manuscrito. XJ analizó los datos, revisó el manuscrito. MMW diseñó el estudio, analizó los datos, preparó las cifras, escribió el manuscrito.

Correspondencia a Michael M. Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lee, SJ, Gasche, MB, Burrows, CJ et al. Respuestas preferenciales de anticuerpos de conejo a los inmunógenos del péptido C-terminal de NOTCH3. Informe científico 13, 9156 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36067-7

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Recibido: 03 febrero 2023

Aceptado: 29 de mayo de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36067-7

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