El paisaje metabólico del intestino del ratón macho identifica diferentes nichos determinados por actividades microbianas

Naturaleza Metabolismo (2023)Citar este artículo

5619 Accesos

41 Altmetric

Detalles de métricas

Nichos distintos del intestino de los mamíferos están poblados por microbiota diversa, pero la contribución de la variación espacial al metabolismo intestinal sigue sin estar clara. Aquí presentamos un mapa del metaboloma longitudinal a lo largo del intestino de ratones macho sanos colonizados y libres de gérmenes. Con este mapa, revelamos un cambio general de aminoácidos en el intestino delgado a ácidos orgánicos, vitaminas y nucleótidos en el intestino grueso. Comparamos los paisajes metabólicos en ratones colonizados versus libres de gérmenes para desentrañar el origen de muchos metabolitos en diferentes nichos, lo que en algunos casos nos permite inferir los procesos subyacentes o identificar las especies productoras. Más allá del impacto conocido de la dieta en el nicho metabólico del intestino delgado, distintos patrones espaciales sugieren una influencia microbiana específica en el metaboloma del intestino delgado. Por lo tanto, presentamos un mapa del metabolismo intestinal e identificamos asociaciones de metabolitos y microbios, que proporcionan una base para conectar la aparición espacial de compuestos bioactivos con el metabolismo del huésped o del microorganismo.

El intestino de los mamíferos está poblado por una amplia variedad de microorganismos, denominados colectivamente microbiota intestinal1,2. La microbiota contribuye a la digestión y a las funciones inmunitarias, y su alteración está vinculada a múltiples enfermedades3,4. Además de las funciones digestivas y de prevenir (o causar) infecciones, los microorganismos intestinales también son fuente de compuestos bioactivos que influyen en el huésped y otros microorganismos3. Los intestinos delgado y grueso son fisiológicamente más distintos y están colonizados por composiciones conservadas de taxones4,5. El duodeno recibe los nutrientes de la dieta, las secreciones pancreatobiliares y gástricas. Las diferencias regionales en la permeabilidad de los tejidos, las proteínas de transporte de absorción, el pH, la señalización reguladora y las respuestas inmunitarias distinguen aún más las subregiones yeyunal e ileal dentro del intestino delgado5. El perfil comunitario en modelos animales ha demostrado distintas composiciones de microbiota en las diferentes regiones intestinales4,6,7. Más allá de estas diferencias longitudinales, existe una variación considerable con respecto a la fisiología y composición de la microbiota entre el contenido luminal y el moco intestinal8. Esta última es una matriz densa, particularmente en el colon, que consta de glicoproteínas de mucina entrecruzadas que separan las células epiteliales del revestimiento intestinal de la luz y su microbiota9. La gruesa capa externa de moco colónico también representa un hábitat y una fuente de nutrientes para los microorganismos especializados en la descomposición de la mucina8,10. Los Clostridia, que pueblan y degradan la mucosidad intestinal, ciertos Firmicutes que producen ácidos grasos de cadena corta característicos o derivados de aminoácidos en el intestino grueso, o bacterias productoras de vitaminas específicas en varios sitios intestinales, ejemplifican una mayor comprensión del panorama funcional del tracto digestivo. ,11,12,13,14,15.

Las diferencias biogeográficas en la composición taxonómica y la actividad metabólica no pueden evaluarse utilizando muestras fecales porque probablemente restringen el poder explicativo, dentro de ciertos límites, al colon distal4,16. Esto es particularmente cierto para el intestino delgado, donde la afluencia de la dieta, los tiempos de transición rápidos y la secreción de enzimas digestivas y antimicrobianos dominan los procesos intestinales y dan forma al microbioma6,17,18. Para avanzar hacia la causalidad, la información detallada sobre las poblaciones bacterianas y sus procesos metabólicos en diferentes subregiones intestinales puede ayudar a identificar el origen de los metabolitos. La mayoría de los componentes de la dieta se metabolizan y absorben en el intestino delgado, dejando fibras y xenobióticos, así como una pequeña fracción de proteínas y lípidos ingeridos, disponibles para la microbiota del colon proximal17. Por lo tanto, gran parte de la actividad microbiana no es evidente en las muestras fecales, incluidos muchos de los compuestos bioactivos de origen microbiano que también están presentes en el intestino delgado19. El análisis de la actividad microbiana en el intestino delgado de humanos requiere cirugía, intubación peroral muy extensa o purga antes de la endoscopia. En consecuencia, se utilizan modelos animales para investigar el intestino en su totalidad20,21. Un ejemplo reciente informó concentraciones de metabolitos a lo largo del intestino en ratones colonizados, descubriendo nuevos conjugados de ácidos biliares derivados de la microbiota que afectan la química de todos los órganos, estableciendo un vínculo causal entre los microorganismos y su efecto en el huésped7. Dada la gran cantidad de microorganismos diferentes en los diversos nichos intestinales y sus diversas actividades metabólicas, estos ácidos biliares recién descubiertos son solo un ejemplo que ilustra el enorme espacio de interacciones huésped-microbio y microbio-microbio basadas en metabolitos que esperan ser desentrañadas.

Aquí, caracterizamos el metabolismo intestinal local y la composición de la comunidad en el contenido luminal y la mucosidad de 15 sitios a lo largo del intestino de ratones sanos libres de patógenos específicos (SPF) y libres de gérmenes machos. Además de caracterizar los cuatro hábitats intestinales principales de contenido luminal y moco en los intestinos delgado y grueso, este panorama metabólico reveló procesos metabólicos previamente no considerados dentro del intestino delgado. Además, identificamos 35 compuestos intestinales como metabolitos derivados de microorganismos que representan una base para estudios sobre el metabolismo intestinal específico de nicho.

Para graficar sistemáticamente la composición del metaboloma a lo largo del tracto intestinal, tomamos muestras de todo el intestino de cinco ratones SPF C57BL/6J macho en 15 ubicaciones discretas (Datos extendidos Fig. 1a) y separamos el contenido luminal del moco intestinal. Para minimizar la variabilidad biológica, los ratones de 10 a 14 semanas de edad recibieron una dieta de laboratorio estándar ad libitum y se mantuvieron en ayunas durante 4 h antes de la toma de muestras, de modo que la mayor parte del alimento llegara al ciego21. Cada muestra de metaboloma contenía metabolitos microbianos intracelulares, así como metabolitos extracelulares derivados de la dieta, el ratón o la actividad microbiana y, por lo tanto, era una mezcla compleja de clases de compuestos químicos en altas concentraciones de sal. Para cuantificar estos compuestos relevantes para el intestino, adoptamos un flujo de trabajo de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TOF-MS) de cromatografía líquida22. Brevemente, optimizamos el tiempo de ejecución del método y establecimos una combinación de estándares analíticos para cuantificar 138 metabolitos que son característicos del metaboloma intestinal, incluidos compuestos en el metabolismo de aminoácidos y nucleótidos, azúcares y otras fuentes de carbono, ácidos biliares y productos de fermentación (Datos extendidos). Fig. 1b y Tabla Suplementaria 1). De estos 138 metabolitos, 128 podrían cuantificarse de manera confiable en función de los parámetros de control de calidad (Tabla complementaria 1 y Datos complementarios). La concentración promedio en el lumen intestinal SPF de estos metabolitos fue de aproximadamente 290 nmol mg-1 de muestra en el intestino delgado y 1,5 µmol mg-1 en el intestino grueso.

El análisis resuelto espacialmente del contenido luminal SPF y la mucosidad nos permitió caracterizar el paisaje metabólico heterogéneo del intestino del ratón. Los perfiles de metabolitos de más de 15 sitios se agruparon jerárquicamente por contenido (Fig. 1a) y, para facilitar la comparación, los perfiles de moco se clasificaron de acuerdo con los grupos de contenido (Datos extendidos, Fig. 1c). Los ácidos biliares, los aminoácidos y sus derivados fueron detectables en todos los sitios pero tenían patrones espaciales distintos con tres sitios principales de concentraciones máximas: estómago, intestino delgado e intestino grueso. El contenido estomacal se caracterizó por altas concentraciones principalmente de aminoácidos (Fig. 1a). Los aminoácidos proteinogénicos y sus derivados se encontraron casi exclusivamente en el intestino delgado. El grupo del intestino grueso estuvo dominado por ácidos orgánicos, vitaminas y compuestos en el metabolismo de los nucleótidos. El análisis de componentes principales (PCA) separó el intestino delgado y el grueso, impulsado principalmente por los aminoácidos y sus derivados a lo largo del primer componente principal, lo que corrobora las diferencias globales entre las dos regiones (Fig. 1b). Dentro del intestino grueso, el segundo componente principal separó aún más los perfiles del metaboloma del contenido luminal del moco. En general, las concentraciones de metabolitos en el contenido luminal fueron en promedio 1,7 veces más altas que en el moco con ácidos biliares, fuentes de carbono, derivados de aminoácidos y ácidos orgánicos como impulsores de la separación (Fig. 1c y Tabla complementaria 2). Solo la espermidina, la creatina y el malato fueron significativamente más abundantes en el moco que en las muestras luminales (P ≤ 0,05, cambio de pliegue ≥3). Las altas concentraciones de espermidina fueron presumiblemente una consecuencia de la producción de poliamina microbiana, que es importante para mantener una capa de moco saludable, particularmente en el intestino grueso23 (Fig. 1c y Datos ampliados, Fig. 1d). En línea con concentraciones de poliamina más altas, las concentraciones de los precursores de poliamina arginina y ornitina fueron más bajas en la mucosidad del intestino grueso que en el contenido luminal (Datos extendidos Fig. 1d y Tabla complementaria 2).

a, Análisis de agrupamiento jerárquico de la abundancia de metabolitos de muestras de contenido luminal de ratones SPF macho. Las abundancias de los 128 metabolitos cuantificados se muestran como concentraciones normalizadas de puntuación z, promediadas de cinco ratones, en los 15 sitios de muestreo. El agrupamiento basado en la distancia euclidiana identificó tres grupos principales correspondientes a las tres principales regiones fisiológicas del tracto digestivo: estómago, intestino delgado e intestino grueso. Los metabolitos están codificados por colores según MetaCyc (abajo a la derecha). b, PCA de concentraciones de metabolitos de ratones SPF macho individuales en base a las 150 muestras luminales y de moco que cubren todo el intestino. PCA se realizó en concentraciones de metabolitos normalizados con puntuación z, con cinco ratones por muestra. Los colores indican sitios agrupados por región intestinal, los símbolos indican lumen o moco y el grupo de contenido del intestino grueso está resaltado en gris. c, Análisis diferencial de las concentraciones de metabolitos entre el contenido luminal y las muestras de moco. Las concentraciones se promediaron en los 15 sitios de muestreo para cinco ratones macho dentro del hábitat respectivo. Los cambios de pliegue positivos o negativos indican concentraciones más altas en el lumen o moco, respectivamente. Los valores de P se calcularon utilizando una prueba t de Student de muestras pareadas de dos caras con corrección de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples y se muestran como -log10 transformado. Los metabolitos con concentraciones significativamente diferentes (log2 absoluto (cambio de veces) ≥ 1,5, P corregido ≤ 0,05) están coloreados de acuerdo con la clasificación MetaCyc, tal como se define en el cuadro a continuación. Los tipos de muestreo de lumen y moco se representan esquemáticamente a la izquierda, alineados con las partes correspondientes del gráfico del volcán. Abreviaturas: FC, cambio de pliegue.

Datos fuente

Para identificar metabolitos específicos que distinguen el intestino delgado del intestino grueso, calculamos los cambios de pliegue de las concentraciones medias de metabolitos en el intestino delgado y grueso, por separado para el contenido luminal y la mucosidad, en los sitios de muestreo y los individuos. Este análisis diferencial reveló altas concentraciones de aminoácidos y metabolitos relacionados en el intestino delgado, particularmente en el moco (Fig. 2a, by Tabla complementaria 3). Dada la capa de moco bastante delgada en el intestino delgado, no podemos excluir que las concentraciones más altas de aminoácidos proteinogénicos puedan, al menos en parte, ser causadas por el arrastre de la luz durante el muestreo. Los ejemplos representativos fueron la histidina y el triptófano, cuyas concentraciones fueron consistentemente más altas en todo el intestino delgado y cayeron inmediatamente en el intestino grueso (Fig. 2c). El intestino grueso se caracterizó por concentraciones más altas de ácidos orgánicos, vitaminas y compuestos en el metabolismo de aminoácidos y nucleótidos (Fig. 2a,b). En general, 31 metabolitos tenían concentraciones al menos cuatro veces más altas en el contenido luminal o moco del intestino grueso con su mayor carga bacteriana en comparación con el intestino delgado (Tabla complementaria 3), lo que indica actividad microbiana. El fuerte aumento de los ácidos grasos de cadena corta como el butirato/isobutirato, los productos de descomposición del azúcar como el glicerato y los productos de degradación de aminoácidos como el 4-hidroxifenilacetato indicaron una fermentación microbiana extensa (Fig. 2d). Aunque PCA no distinguió regiones dentro de la mucosidad intestinal (Fig. 1b), el análisis diferencial reveló un cambio metabólico distinto de aminoácidos a productos de fermentación en la mucosidad (Fig. 2a (abajo), Fig. 2b (derecha) y Fig. 2c ), proporcionando evidencia de las diferencias metabólicas entre los hábitats del moco intestinal delgado y grueso.

a, Análisis diferencial de concentraciones de metabolitos entre muestras de intestino delgado y grueso en lumen (superior) y moco (inferior). Los puntos de datos representan valores medios de cambio de pliegue calculados entre diez sitios del intestino delgado y cuatro del intestino grueso, para cinco ratones macho. Los valores negativos y positivos representan concentraciones más altas en el intestino delgado o grueso, respectivamente. El eje y muestra los valores de P transformados en −log10, calculados mediante una prueba t de Student de muestra emparejada bilateral con corrección de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples. Los metabolitos con concentraciones significativamente diferentes (log2 absoluto (cambio de pliegue) ≥ 2, P corregido ≤ 0,05) están codificados por colores de acuerdo con la clasificación MetaCyc, como se define en el cuadro (abajo a la izquierda). b, Cambio significativo de metabolitos entre el intestino delgado y grueso en la luz y el moco del análisis diferencial en la Fig. 1a (log2 absoluto (cambio de veces) ≥ 2, P corregido ≤ 0.05). Los valores de p se calcularon utilizando una prueba t de Student de muestras pareadas de dos caras con corrección de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples. Los colores de los puntos denotan cambios en el pliegue y el tamaño de los puntos denota importancia. Los metabolitos se clasifican según MetaCyc, como se define en el cuadro (abajo a la izquierda). c, d, Perfiles espaciales de histidina y triptófano (c) y glicerato y 4-hidroxifenilacetato (d) en 15 sitios intestinales en moco o luz SPF, respectivamente. Las líneas con áreas sombreadas indican el promedio móvil de la media ± sem de las mediciones de concentración de cinco ratones macho. Abreviaturas: cec, caecum; columna, dos puntos; dúo, duodeno; íleon, íleon; yeyuno, yeyuno; sto, estómago; TMAO, N-óxido de trimetilamina.

Datos fuente

El patrón general del metaboloma no nos permitió distinguir sitios individuales dentro del intestino delgado o grueso porque las diferencias entre ratones individuales en estos sitios eran, como era de esperar24, igual de grandes (Fig. 1b), pero alrededor de un tercio de los metabolitos exhibieron distintas longitudes longitudinales. perfiles (Fig. 3 y Tabla Suplementaria 4). La agrupación jerárquica de las concentraciones de metabolitos en el intestino delgado dio como resultado tres grupos: metabolitos con una concentración máxima en el duodeno, el yeyuno o el íleon (Datos ampliados Fig. 2). Aunque las tres clases se distribuyeron por igual en muestras luminales, la mayoría de las concentraciones de moco disminuyeron hacia el íleon en las muestras de intestino delgado (Datos extendidos Fig. 2b, c). Los metabolitos con altas concentraciones en el contenido del duodeno incluyeron fructosa (Fig. 3a) y otros monosacáridos, presumiblemente componentes dietéticos residuales que habían sido absorbidos por el huésped antes de llegar al intestino delgado distal14,25. Las concentraciones de riboflavina fueron más altas en el contenido de yeyuno, ya sea por la producción microbiana o por las vitaminas residuales de la dieta14,15,26. Las altas concentraciones de alantoína en el contenido ileal (Fig. 3a) probablemente se debieron a la degradación microbiana de los metabolitos de purina en la parte superior del intestino delgado de ratones coprófagos27, en consonancia con las altas concentraciones de guanina y guanosina en el moco duodenal (Fig. 3b) y la mayor entrada de guanina y guanosina a través de la dieta chow. Las altas concentraciones de creatina en el moco yeyunal pueden ser el resultado de la creatina dietética, mientras que la disminución de la concentración probablemente se debió a la absorción por parte de células intestinales que requieren mucha energía y que expresan varios transportadores de creatina y enzimas metabolizadoras de creatina28. En el intestino grueso, la agrupación jerárquica reveló concentraciones máximas de contenido luminal principalmente en el colon distal, mientras que las concentraciones máximas de moco se distribuyeron de manera más uniforme en todo el intestino grueso (Datos ampliados, Fig. 3). En el contenido luminal, las concentraciones de uracilo fueron más altas en el colon distal, mientras que el butirato/isobutirato pareció disminuir ligeramente hacia el colon distal (Fig. 3c), donde el butirato es la principal fuente de energía de los colonocitos29. En la mucosidad del intestino grueso, el glicerato25, producto de la descomposición de la fructosa, alcanzó su punto máximo en el ciego, pero disminuyó bruscamente en el colon. En conjunto, nuestros datos sugieren que la actividad microbiana es un posible factor que contribuye a los perfiles de concentración longitudinal de 42 metabolitos del intestino delgado.

a–c, Perfiles de ejemplo de metabolitos con concentración diferencial en el contenido del intestino delgado (a) y moco (b), o en el contenido luminal o moco del intestino grueso (c). Las líneas con áreas sombreadas indican el promedio móvil de la media ± sem de las mediciones de concentración de cinco ratones macho. Las concentraciones de metabolitos significativamente diferentes de una región del intestino delgado en comparación con la región vecina están marcadas con asteriscos (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Concentración de contenido intestinal de fructosa en duodeno versus yeyuno: P = 0,0245; concentraciones de contenido intestinal de riboflavina en yeyuno versus íleon: P = 0,0432; concentraciones de contenido intestinal de alantoína en yeyuno versus íleon: P = 0,0220; concentraciones de moco de guanina en el duodeno frente al yeyuno: P = 0,0005; concentraciones de moco de guanosina en el duodeno frente al yeyuno: P = 0,0129; concentraciones de moco de creatina en el yeyuno frente al íleon: P = 0,0278. Los valores de p se calcularon utilizando una prueba t de Student de muestras pareadas bilaterales. Abreviaturas: sto, estómago; dúo, duodeno; yeyuno, yeyuno; íleon, íleon; cec, ciego; y col, dos puntos.

Datos fuente

Este mapa del metabolismo intestinal en ratones SPF destaca el contenido luminal y la mucosidad del intestino delgado y grueso como nichos principales con un patrón de metaboloma en gran parte consistente en múltiples sitios de muestreo. El cambio general de concentraciones más altas de aminoácidos y sus derivados en el intestino delgado a vitaminas y productos de fermentación en el intestino grueso se debe presumiblemente a una mayor actividad microbiana en el intestino grueso, lo que indica un origen microbiano para 31 metabolitos. Además, cuantificamos patrones sustanciales dentro del intestino delgado para 42 de los 128 metabolitos medidos. Debido a que estas diferencias metabólicas podrían, al menos en parte, resultar de la actividad microbiana en diferentes regiones del intestino, a continuación investigamos el papel de la microbiota.

Las altas concentraciones de metabolitos en el intestino grueso (Fig. 2a), conocida por su extensa actividad microbiana13,14,29, y el patrón espacial de metabolitos en el intestino delgado (Fig. 3) proporcionaron solo evidencia indirecta de un origen microbiano. Además de ser derivados de microorganismos, estos metabolitos también podrían ser metabolitos del huésped producidos como respuesta a microorganismos, componentes dietéticos residuales o metabolitos intracelulares de células intestinales eliminadas. Para obtener evidencia más directa de la influencia microbiana en el metabolismo intestinal y diseccionar los cambios longitudinales en los metabolitos afectados, realizamos un experimento de emparejamiento con cinco ratones machos C57BL/6J libres de gérmenes, cuyo contenido intestinal y mucosidad se muestrearon en los mismos 15 sitios después ayuno. Generalmente, al menos dos tercios de los metabolitos tenían concentraciones más altas en presencia de bacterias; casi el 50% del contenido luminal y el 30% de los metabolitos del moco tenían concentraciones al menos dos veces más altas en ratones SPF que en ratones libres de gérmenes (Datos extendidos, Fig. 4a y Tablas complementarias 5 y 6). Los metabolitos con concentraciones particularmente altas en ratones SPF incluyeron ácidos biliares, ácidos orgánicos, compuestos aromáticos, vitaminas y derivados de aminoácidos (Tablas complementarias 5 y 6). Solo alrededor de una cuarta parte de los metabolitos fueron más abundantes en ratones libres de gérmenes, principalmente fuentes de carbono y compuestos de nucleótidos, así como el metabolismo de aminoácidos que podrían ser de origen dietético y son agotados por la microbiota en ratones SPF30.

Entre los 31 metabolitos anteriores de origen microbiano potencial, 24 tenían concentraciones medias al menos cuatro veces más altas en el intestino grueso de ratones SPF en comparación con ratones libres de gérmenes (Fig. 4a y Tabla complementaria 7). Los ácidos grasos de cadena corta butirato/isobutirato e isovalerato/valerato, y los ácidos biliares secundarios litocolato e hiodesoxicolato tenían concentraciones al menos 14 veces más altas en el intestino grueso de ratones SPF. Tales altas concentraciones son consistentes con su bien conocida formación por los abundantes Bacteroidales que toleran el bajo nivel de oxígeno y el bajo pH en el colon4,31. La biotina, el indol-3-propionato y el glicerol se detectaron exclusivamente en ratones SPF, lo que proporciona una fuerte evidencia de su origen microbiano. El indol-3-propionato es un compuesto derivado de la microbiota intestinal bien establecido que resulta del metabolismo del triptófano13,32. Para la mayoría de los 31 metabolitos del intestino grueso, nuestra hipótesis de origen microbiano fue consistente con estudios dirigidos o niveles más altos previamente observados en ratones colonizados que en ratones libres de gérmenes3,19,30,32,33 (Fig. 4a y Tabla Suplementaria 7 ). La mayor concentración de SPF del omnipresente metabolito intracelular 2-oxoglutarato (Fig. 4b) probablemente se explica por la alta carga bacteriana, como se describió anteriormente34. Los metabolitos de origen microbiano recientemente identificados fueron hidrocinamato, 3-hidroxibutirato, caproato, adenosina y fucosa/ramnosa (Fig. 4c y datos ampliados, Fig. 4b). Similar al fenilacetato y al 4-hidroxifenilacetato, el hidrocinamato puede resultar de la fermentación de aminoácidos aromáticos, como se muestra in vitro para varios microorganismos intestinales35. Asimismo, el 3-hidroxibutirato y el caproato son productos de fermentación36. Los azúcares como la fucosa/ramnosa se liberan muy probablemente de las fibras dietéticas a través de glucósidos hidrolasas microbianas secretadas. De acuerdo con observaciones previas19,30, las concentraciones más altas de creatina y guanosina en el intestino grueso en ratones libres de gérmenes sugieren un origen del huésped o de la dieta (Fig. 4a). En conjunto, las concentraciones más altas de metabolitos en ratones SPF que en ratones libres de gérmenes proporcionan evidencia de apoyo para el origen microbiano o la producción del huésped inducida por microbiota de 24 de los 31 metabolitos con altas concentraciones en el intestino grueso.

a, Abundancia de cambios en el pliegue de 31 metabolitos con concentraciones más altas en el intestino grueso que en el intestino delgado, por lo que se supone que es de origen microbiano (cambiando significativamente los metabolitos del análisis diferencial; Fig. 2a, b). Los cambios de pliegue transformados en log2 para el contenido luminal (izquierda) y la mucosidad (derecha) se calcularon a partir de las concentraciones promediadas para los cuatro sitios de muestreo del intestino grueso de cinco ratones SPF macho frente a cinco ratones libres de gérmenes macho. Los diagramas de caja se basan, por lo tanto, en 20 puntos de datos, el log2 mediano (cambio de pliegue) se indica en rojo, las cajas contienen los percentiles 25 a 75 y los bigotes se extienden a los puntos de datos más extremos que no se consideran valores atípicos. El área gris marca log2 absoluto (cambio de pliegue) ≤ 2. Los símbolos a la izquierda indican evidencia previa: () conocimiento común sobre ciertos metabolitos, por ejemplo, ver Koh et al. y de Aguiar Vallim et al.29,66; (Δ) evidencia de Han et al.19 utilizando la comparación de ratones libres de gérmenes Swiss-Webster versus ratones convencionales para identificar abundancias diferenciales de metabolitos; (□) evidencia de Matsumoto et al.33 usando ratones libres de gérmenes y 'ex-libres de gérmenes' que fueron inoculados en el estómago con suspensión fecal de ratones SPF BALB/c para clasificar los metabolitos como derivados de ratones o microorganismos; () evidencia de Marcobal et al.30 quienes utilizaron ratones Swiss-Webster convencionales y libres de gérmenes para comparar los niveles de metabolitos; () evidencia de Sridharan et al.32 utilizando modelos de redes de reacción para predecir productos metabólicos dependientes de la microbiota. Todos los datos utilizados del trabajo publicado, incluidas las explicaciones, se pueden encontrar en la Tabla complementaria 7. Además, (◯) denota metabolitos detectados exclusivamente en ratones SPF macho. Para los metabolitos exclusivos de SPF, no se pueden calcular los cambios de pliegue, como lo indica ∞. b, c, Concentración intestinal gruesa de 2-oxoglutarato (b) e hidrocinamato (c) en SPF y contenido luminal libre de gérmenes y moco. Las barras sólidas muestran la concentración media de las mediciones de cinco ratones machos, promediadas en los cuatro sitios del intestino grueso. Los 20 puntos de datos correspondientes se muestran como círculos. Abreviaturas: FC, cambio de pliegue; cont, contenido lumínico; GF, libre de gérmenes; moco, moco.

Datos fuente

Para descartar contribuciones dietéticas a concentraciones elevadas de metabolitos, determinamos la composición de los gránulos de la dieta chow usando espectrometría de masas de tiempo de vuelo con análisis de inyección de flujo no dirigido (FIA-TOF-MS)37. En resumen, disolvimos y extrajimos tres gránulos de alimentos según el protocolo utilizado para muestras intestinales. Con base en patrones isotópicos y de masa precisos, supuestamente anotamos 1.379 iones de metabolitos. A pesar de las diferencias en las eficiencias de ionización, las intensidades medidas nos permitieron estimar aproximadamente la abundancia relativa de los compuestos detectados. La distribución de las abundancias aparentes fue notablemente sesgada. Diecisiete metabolitos constituyeron el 50% de la señal total registrada en los gránulos (Tabla complementaria 9), siendo los disacáridos el contribuyente dominante (14% en promedio). Otros metabolitos abundantes fueron adenina, malato, hexosas, lisina, guanosina, guanina y triptófano. Las altas concentraciones dietéticas de los nucleótidos de purina guanosina y guanina explican su abundancia en ratones libres de gérmenes y las bajas concentraciones en el intestino SPF, donde observamos un aumento concomitante en el producto de descomposición de las purinas, la alantoína. Lo que es más importante, ninguno de los 24 metabolitos que encontramos relacionados con la microbiota contribuyó en más del 0,05 % a la composición de la dieta. Por lo tanto, la abundancia de estos marcadores en la dieta parece tener un papel menor.

Por último, buscamos evidencia de origen microbiano entre los 42 metabolitos con un patrón longitudinal en el intestino delgado de ratones SPF. Con la excepción del fenillactato, ninguno de ellos coincidió con nuestro criterio de una concentración cuatro veces mayor en ratones SPF en comparación con ratones libres de gérmenes al promediar los diez sitios de muestreo (Datos extendidos Fig. 5a). Sin embargo, en ubicaciones específicas dentro del intestino delgado, ocho contenido luminal y dos metabolitos de moco alcanzaron concentraciones cuatro veces más altas en ratones SPF que en ratones libres de gérmenes cuando se considera el duodeno, el yeyuno y el íleon por separado (Fig. 5a y Datos extendidos Fig. 5b, C). Por ejemplo, las concentraciones del producto final del metabolismo de las purinas, la alantoína, aumentaron en todo el intestino delgado de los ratones SPF, alcanzando un máximo en el íleon, mientras que los niveles permanecieron bajos en los ratones libres de gérmenes (Fig. 5b). De manera consistente, las concentraciones de los metabolitos de purina en la dieta guanina, guanosina e hipoxantina fueron más bajas en ratones SPF que en ratones libres de gérmenes (Fig. 5c), lo que proporciona evidencia de su descomposición microbiana y posterior conversión a alantoína. Se observó un perfil diferente para la creatina, cuya concentración aumentó inicialmente en la mucosidad de los ratones SPF y libres de gérmenes, pero cayó a la línea de base en los ratones libres de gérmenes mientras alcanzaba un máximo en el yeyuno de los ratones SPF (Fig. 5d). El aumento inicial de la concentración coincidente posiblemente se debió a su presencia en la dieta, pero el patrón diferencial en el yeyuno indicó producción microbiana o alteración microbiana del consumo de creatina por parte de las células intestinales35. Los otros ocho metabolitos con concentraciones máximas más altas en ratones SPF incluyeron varios compuestos relacionados con el metabolismo de aminoácidos o nucleótidos. Un ejemplo es la indoleacetilglicina aromática derivada del indol, cuya concentración fluctuó a lo largo del intestino delgado SPF, pero estaba por debajo del límite de detección en el intestino delgado distal de ratones libres de gérmenes (Datos extendidos Fig. 5b), lo que sugiere fuertemente una influencia microbiana . Las concentraciones consistentemente más altas en el intestino delgado de citidina 5-monofosfato, uracilo e histidina se explican mejor como metabolitos microbianos intracelulares. Además de los 24 metabolitos en el intestino grueso, proporcionamos evidencia del origen microbiano de 11 metabolitos en el intestino delgado.

a, representación de mapa de calor de metabolitos con concentraciones al menos cuatro veces más altas en ratones macho SPF que en ratones macho libres de gérmenes, específicamente en una ubicación del intestino delgado frente a todo el intestino delgado. La columna de la izquierda muestra los cambios de pliegue promedio transformados en log2 de los diez sitios del intestino delgado (SPF versus libre de gérmenes), y las siguientes tres columnas representan los cambios de pliegue promedio (SPF versus libre de gérmenes) en el duodeno, yeyuno o íleon por separado . A partir de perfiles espaciales (como en la Fig. 3, aquí no se muestran todos), identificamos la región (duodeno, yeyuno o íleon) que varía de su región vecina. Para esa región, marcada con un asterisco, sospechamos que la implicación microbiana causa la clara diferencia y, en consecuencia, también un SPF más alto que la concentración libre de gérmenes. b, Perfiles espaciales de concentraciones de alantoína en SPF y contenido luminal libre de gérmenes. Las líneas con un área sombreada indican el promedio móvil de la media ± sem de las mediciones de concentración de cinco ratones macho. c, Concentraciones en intestino delgado de guanina, guanosina e hipoxantina en SPF y contenido luminal libre de gérmenes y moco. Las barras sólidas muestran la concentración media de las mediciones de cinco ratones macho, en diez sitios del intestino delgado. Los 50 puntos de datos correspondientes se muestran como círculos. d, Perfiles espaciales de concentraciones de creatina en SPF y moco libre de gérmenes. Las líneas con un área sombreada indican el promedio móvil de la media ± sem de mediciones de concentración con cinco ratones macho. Abreviaturas: FC, cambio de pliegue; GF, libre de gérmenes; contra, contra; sto, estómago; dúo, duodeno; yeyuno, yeyuno; íleon, íleon; cec, ciego; columna, dos puntos; cont – contenido lumínico; moco – moco; NaN, no un número (no se pudieron calcular los cambios de pliegue).

Datos fuente

Para investigar si los patrones del metaboloma estaban asociados con la composición del microbioma, perfilamos el contenido luminal y la composición de la comunidad de moco utilizando la secuenciación de ARN ribosómico 16S del duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon de cinco ratones SPF macho coalojados de la misma camada. En los cinco sitios, la comunidad estuvo dominada a nivel de phylum por Firmicutes y a nivel de familia por Lachnospiraceae, Oscillospiraceae, Lactobacillaceae y Bacteroidaceae (Datos extendidos Fig. 6a). Como era de esperar7, la abundancia relativa de Bacteroidales aumentó en el intestino grueso, particularmente en las muestras del lumen, coincidiendo con concentraciones altas de ácidos grasos de cadena corta y ácidos biliares secundarios. De acuerdo con los patrones del metaboloma, la composición de la comunidad fue en gran medida invariable en los tres sitios del intestino delgado. Las principales diferencias entre el contenido luminal y el moco con respecto a la composición fueron una diversidad generalmente mayor y la abundancia relativa de Akkermansiaceae en el contenido luminal (Datos extendidos Fig. 6a). Estas diferencias fueron más pronunciadas en el yeyuno, donde hasta el 20% de toda la comunidad de contenido eran Akkermansiaceae.

Para evaluar la contribución de los microorganismos al metaboloma intestinal medido, determinamos el potencial funcional del microbioma utilizando la herramienta PICRUSt238 que predice el conjunto de enzimas de cada microorganismo detectado. Al comparar el conjunto obtenido de todas las posibles reacciones microbianas con el conjunto conocido de reacciones metabólicas en ratones de la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG), los metabolitos se clasificaron como potencialmente vinculados al huésped (7), el microbioma (13) o ambos (81) (Fig. 6a). Por ejemplo, las altas concentraciones de espermina e hidrocinamato en ratones SPF se explican mejor por el origen del huésped y del microbioma, respectivamente. Para identificar las especies productoras, correlacionamos las abundancias de metabolitos y microorganismos espacialmente a lo largo del intestino SPF. En general, los coeficientes de correlación exhibieron una distribución normal, con 620 pares de metabolitos y microbios que mostraron una coocurrencia significativa (P <0.01) (Fig. 6b). Para refinar las predicciones de la producción microbiana potencial, consideramos solo los metabolitos que eran más abundantes en ratones SPF que en ratones libres de gérmenes (cambio de veces> 2). Con base en las reacciones metabólicas microbianas pronosticadas anteriormente, restringimos aún más nuestro análisis a pares en los que los microorganismos pronosticados poseen enzimas que catalizan reacciones que involucran al metabolito emparejado. En total, predijimos 148 pares de producción potencial de metabolitos microbianos a partir de la correlación de 20 metabolitos con la abundancia de 91 microorganismos que abarcan 14 órdenes bacterianos diferentes (Fig. 6c y Tabla complementaria 10). Como era de esperar por su naturaleza ubicua, los intermediarios metabólicos como el n-acetilglutamato y el glicerato, producto de la descomposición de la fructosa, se relacionaron con 41 y 22 microorganismos, respectivamente. Diez metabolitos se vincularon más específicamente a tres o menos microorganismos, incluido un solo vínculo de microorganismo para butirato, quenodesoxicolato, ramnosa y succinato. Para el butirato y el quenodesoxicolato, que son los metabolitos con el SPF más alto en comparación con el cambio de pliegue libre de gérmenes, identificamos un grupo no clasificado del conocido productor de ácidos grasos de cadena corta Lachnospiraceae39 y miembros del grupo Lachnospiraceae NK4A136 como los microorganismos responsables, respectivamente (Fig. .6d). Estas y otras coocurrencias espaciales observadas de metabolitos con microorganismos específicos fortalecen aún más nuestro vínculo hipotético con la actividad microbiana.

a, Diagrama de Venn que muestra la superposición de 128 metabolitos medidos clasificados como relacionados con el huésped o el microorganismo, según las predicciones de PICRUSt2 de las funciones metabólicas microbianas y la red metabólica del ratón. La mayoría de los metabolitos no se pueden clasificar como asociados con el huésped o los microbios, siete metabolitos están relacionados con el huésped y trece metabolitos están relacionados con microorganismos. Veintisiete metabolitos no coincidían con ninguna de las redes metabólicas. b, Distribución de los coeficientes de correlación de 126.336 pares de metabolitos-microbios. Las barras ampliadas muestran cómo la aplicación de umbrales en el valor P, el cambio de pliegue libre de gérmenes SPF y la presencia de enzimas metabólicas reduce el número de pares de microbios-metabolitos funcionales previstos a 148. c, Diagrama de Sankey que muestra vínculos entre metabolitos únicos y los órdenes microbianos correspondientes en pares de metabolito-microbio correlacionados positivamente que cumplen los umbrales definidos en b. Los metabolitos están codificados por colores según MetaCyc. El tamaño de la línea de enlace indica el número de pares. d, Perfiles espaciales de concentraciones de metabolitos y microorganismos asociados en muestras de luz SPF. Las líneas con un área sombreada indican la media ± sem de las mediciones de concentración con cinco ratones macho y la media ± sem de la abundancia relativa de microorganismos. Abreviaturas: dúo, duodeno; yeyuno, yeyuno; íleon, íleon; cec, ciego y col, colon.

Datos fuente

Presentamos un mapa resuelto anatómicamente del metabolismo intestinal en ratones macho sanos SPF y libres de gérmenes, que revela el contenido luminal y la mucosidad de los intestinos delgado y grueso como cuatro nichos metabólicamente distintos. El metaboloma del intestino delgado estuvo dominado por aminoácidos y el intestino grueso se caracterizó por altas concentraciones de productos de fermentación, vitaminas y compuestos en el metabolismo de nucleótidos, en consonancia con la densidad mucho mayor de microorganismos en el intestino grueso4. De acuerdo con sus características fisicoquímicas e inmunológicas8,40, la capa de moco externo densamente poblada que recubre el intestino también era metabólicamente distinta, con poliaminas derivadas de microorganismos y creatina como las características más distintivas. Se sabe que la creatina y las poliaminas, como la espermidina, desempeñan un papel clave en el mantenimiento de una capa mucosa saludable, especialmente en presencia de una microbiota35,41,42. Concentraciones extremadamente altas de aminoácidos proteinogénicos distinguieron la fina capa de moco en el intestino delgado de la capa más gruesa en el intestino grueso4, posiblemente como consecuencia de la difusión del contenido luminal o la degradación de proteínas mediada por enzimas.

Además de caracterizar los cuatro nichos intestinales principales, nuestro conjunto de datos resolvió el patrón espacial de 42 metabolitos dentro del intestino delgado, una parte del tracto intestinal a la que es inherentemente difícil acceder18 y donde los microorganismos producen muchos compuestos bioactivos19. Las altas concentraciones de fructosa y otros monosacáridos en el duodeno, aguas abajo del estómago, probablemente se debieron a la descomposición de los componentes de la dieta que luego fueron absorbidos por el huésped14,25,43. Hacia el final del intestino delgado, encontramos evidencia de la conversión microbiana de metabolitos de purina que conducen a altas concentraciones de alantoína en el contenido ileal. Asimismo, altas concentraciones fluctuantes de derivados del indol como la indoleacetilglicina en el intestino delgado de ratones SPF sugirieron un origen microbiano, que hasta el momento se ha descrito principalmente en el intestino grueso44. El metabolismo microbiano del indol es importante porque los indoles regulan la liberación de hormonas intestinales que controlan la digestión del huésped45. Los derivados del indol también señalan como agonistas a través del receptor de hidrocarburos arílicos que regulan la integridad de la barrera epitelial y, en consecuencia, limitan la inflamación intestinal6,46. Nuestros datos de metaboloma de alta resolución, por lo tanto, brindan información sobre la dinámica metabólica asociada con microorganismos dentro de las subregiones del intestino delgado, lo que agrega información funcional a los recursos establecidos, como los datos transcripcionales en el proyecto Tabula Sapiens47 y otros estudios integrales7. Nuestra variabilidad metabólica generalmente es consistente con las fluctuaciones del microbioma reportadas entre diferentes sitios de muestreo dentro de las subregiones intestinales, aunque los datos de metabolitos funcionales parecen variar mucho menos que la composición microbiana, lo que probablemente se explica por la redundancia funcional del microbioma intestinal48.

Con base en la mayor concentración en ratones SPF en comparación con ratones libres de gérmenes, proporcionamos evidencia de un origen microbiano para 11 y 24 metabolitos en el intestino delgado y grueso, respectivamente. Además, al predecir el potencial metabólico del microbioma y realizar análisis de coocurrencia espacial, pudimos identificar microorganismos específicos como productores potenciales de 20 metabolitos. Aunque el nicho metabólico del intestino delgado está determinado principalmente por la dieta y las actividades digestivas del huésped16, demostramos que la microbiota intestinal contribuye a dar forma al metaboloma del intestino delgado más allá del metabolismo de los lípidos y los ácidos biliares6,49. Nuestro mapa metabólico resuelto anatómicamente nos permitió inferir algunos de los procesos subyacentes del patrón de metabolitos, como las altas concentraciones ileales de alantoína que parecen ser el resultado de la descomposición microbiana de las purinas, lo que podría proporcionar nitrógeno en el ambiente generalmente limitado por nitrógeno del intestino50 . Las concentraciones de creatina en aumento continuo en el yeyuno de ratones SPF contrastan con las concentraciones más bajas en ratones libres de gérmenes, lo que sugiere producción microbiana, alteración del consumo de creatina por parte de las células intestinales del huésped35,51 o estimulación de la producción de creatina en el hígado y el riñón28. Los 24 metabolitos derivados de la microbiota en el intestino grueso incluyen varios productos microbianos establecidos, como los ácidos grasos de cadena corta butirato/isobutirato e isovalerato/valerato, así como los ácidos biliares secundarios relacionados con microorganismos litocolato e hiodesoxicolato31,52,53. Varios estudios informaron previamente que diferentes subconjuntos de estos compuestos son muy abundantes en las heces o el colon de ratones colonizados3,19,30,32,33, pero recientemente identificamos hidrocinamato, adenosina, 3-hidroxibutirato, caproato y fucosa/ramnosa como compuestos de origen metabólico microbiano. La ramnosa y la adenosina podrían vincularse a clostridios y bacilos específicos que contienen las enzimas necesarias para su formación. Los microorganismos concurrentes son productores potenciales de los otros tres nuevos compuestos, pero tales correlaciones también pueden resultar indirectamente del crecimiento microbiano en metabolitos alimentados de forma cruzada. Por el contrario, las células eucariotas no pueden producir hidrocinamato (también conocido como propionato de 3-fenilo). Por lo tanto, la concentración 259 veces mayor en el intestino grueso de los ratones SPF en comparación con los ratones libres de gérmenes presumiblemente se debe a la conversión de fenilalanina y tirosina a través de Clostridia13, lo que coincide con la abundancia de clostridios en el intestino grueso que constituye aproximadamente la mitad del total. Microbioma SPF4,13,29. El 3-hidroxibutirato de cuerpo cetónico es un metabolito del huésped con producción primaria en el hígado, pero también es un producto potencial de varios Clostridia identificados en nuestros datos 16S. Su concentración diez veces mayor en el intestino grueso de los ratones SPF puede deberse a la secreción microbiana, la inducción microbiana de la producción de 3-hidroxibutirato por parte del huésped o una combinación de ambos, cuya aclaración requeriría más experimentos.

Hasta donde sabemos, proporcionamos aquí el primer mapa anatómico in vivo de la luz imperturbable y el metabolismo del moco a lo largo de todo el intestino del ratón. Por lo tanto, también consolidamos los hallazgos de estudios previos que investigaron intervenciones dietéticas, modelos de enfermedades o sitios intestinales específicos. La comparación de paisajes metabólicos en ratones SPF colonizados machos versus ratones libres de gérmenes nos permitió desentrañar el origen de muchos metabolitos en diferentes nichos y, en algunos casos, inferir los procesos subyacentes. Estas asociaciones se fortalecen aún más a través de un análisis de correlación que identifica asociaciones específicas de metabolitos y microbios. Aunque carecemos de comparación con las heces, sobre la base de estas diferencias metabólicas y las diferencias informadas en la microbiota7,16, concluimos que el intestino es un entorno demasiado variable para ser aproximado utilizando solo muestras fecales, como se demostró en ratones monocolonizados54. Nuestro conjunto de datos también proporciona un punto de partida para futuros estudios sobre el metabolismo intestinal.

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las regulaciones federales y cantonales suizas. El permiso fue otorgado por la comisión de experimentación animal del Kanton Bern. Se criaron y mantuvieron ratones C57BL/6J macho en el Clean Mouse Facility de la Universidad de Berna, Suiza. Se compraron ratones macho SPF colonizados en un fondo C57BL/6J de Envigo. Se obtuvieron ratones C57BL/6J macho libres de gérmenes mediante cesárea y se mantuvieron en condiciones asépticas dentro de aisladores de película flexible. Se usaron cinco animales replicados por grupo. Todos los ratones tenían entre 10 y 14 semanas de edad, se confirmó que estaban libres de patógenos y se mantuvieron en un ciclo de 14 h de luz/10 h de oscuridad a una temperatura promedio de 20 °C y 40 % de humedad. Todos los ratones recibieron dieta estándar de laboratorio Kliba Nafag 3436 chow y agua ad libitum. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical a la misma hora del día para controlar las variaciones debidas al ritmo circadiano después de 4 h de ayuno, lo que permite completar el tránsito por el intestino delgado55. La dieta residual estará en el ciego y, por lo tanto, los ratones replicados son más comparables. Se recolectaron muestras del contenido luminal y del moco intestinal en 15 sitios a lo largo del intestino, como se describió anteriormente8. En resumen, se resecó todo el tracto gastrointestinal a través de una incisión abdominal. Se separaron las diferentes regiones intestinales (estómago, intestino delgado, ciego y colon), se abrieron longitudinalmente, se extrajo el contenido luminal y se raspó la mucosidad de las paredes intestinales. Las muestras se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido.

Los metabolitos se extrajeron de 50 mg de muestra en 20 volúmenes por peso de agua Millipore a 80 °C. Las muestras se agitaron durante 10 s, se incubaron durante 3 min a 80 °C en un Eppendorf Thermomixer a máxima velocidad (1500 rpm), se agitaron durante 10 s y se centrifugaron durante 3 min a 20 000 g a temperatura ambiente. Del sobrenadante, se transfirieron 150 µl a placas de microtitulación de 96 pocillos y se almacenaron a -80 °C. Para el análisis de espectrometría de masas, las muestras se diluyeron 1:1 en fase móvil (metanol/agua/ácido acético 49,6:49,6:0,8 v/v/v) que contenía el compuesto de referencia de tiempo de retención ácido 9-antraceno carboxílico (Sigma-Aldrich) y almacenado a -20 °C hasta su análisis. Para las extracciones de metabolitos de gránulos de alimentos, se pesaron tres gránulos y se disolvieron en 20 ml de agua Millipore durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, se añadieron 10 ml de agua Millipore y se agitó durante 10 s. Se calentó un mililitro de la suspensión de gránulos alimentarios a 80 °C y se extrajeron los metabolitos como se describe anteriormente (3 min de incubación a 80 °C en un Eppendorf Thermomixer a velocidad máxima (1500 rpm), se agitaron con vórtex durante 10 s y se centrifugaron durante 3 min a 20.000g a temperatura ambiente). Del sobrenadante, se transfirieron 150 µl a placas de microtitulación de 96 pocillos y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Antes de las mediciones, las muestras se diluyeron 1:20 en agua MilliQ.

El metanol y el isopropanol de grado HPLC, todos los productos químicos, los aditivos tampón para la referencia masiva en línea y los productos químicos para la preparación de muestras se adquirieron de Sigma-Aldrich, Agilent Technologies y Cayman Chemicals. El agua de grado HPLC se obtuvo utilizando un sistema de purificación de agua IQ7000 MilliQ equipado con un LC-Pak (Merck).

Las muestras se analizaron en un sistema LC Agilent 1290 Infinity acoplado a un espectrómetro de masas Q-TOF de masas de precisión Agilent 6550 usando ionización por electropulverización de chorro doble Agilent (Agilent Technologies). El volumen de inyección fue de 4 µl y la separación cromatográfica se logró utilizando una columna Zorbax SB-Aq 1,8 µM 2,1 × 50 mm con una precolumna Zorbax SB-C8 y un cartucho de resolución rápida (2,1 × 30 mm 3,5 μm). La elución se logró utilizando un gradiente lineal a una velocidad de flujo de 0,6 ml min-1 comenzando con una fase móvil B al 2 % (0,2 % v/v de ácido acético en metanol) cambiando gradualmente a eluyente B al 98 % durante 13 min. A esto le sigue un flujo isocrático de 1,5 min de fase móvil A al 2 % (0,2 % v/v de ácido acético en agua MilliQ) y equilibrio de 1 min con eluyente B al 2 %. modo negativo utilizando análisis de barrido completo en un rango de masas de m/z 50 a m/z 1700 en modo de adquisición de rango dinámico extendido de 2 GHz. Para la corrección del eje de masa en línea, se añadieron a la fase móvil purina y hexakis (1H,1H,3H-tetrafluoropropoxi)fosfazina (HP-0921; Agilent Technologies). Los ajustes de electropulverización fueron los siguientes: voltaje de pulverización de iones, modo negativo de 3,5 kV y modo positivo de 4 kV; temperatura capilar, 325 °C; flujo de gas de secado, 10 l min−1; y 45 psi de presión del nebulizador.

Las mediciones de metabolómica no dirigida se realizaron utilizando FIA-TOF-MS con una configuración que constaba de una bomba LC Agilent Serie 1100 acoplada a un muestreador automático Gerstel MPS2 y un espectrómetro de masas Q-TOF de masas preciso Agilent 6550 utilizando ionización por electropulverización de chorro doble Agilent (Agilent Technologies) , operado en modo de ionización negativa. El caudal fue de 150 µl min−1 de fase móvil consistente en isopropanol/agua MilliQ (60:40 v/v) tamponada con fluoruro de amonio 1 mM. Además, se añadieron a la fase móvil 1 mM de ácido 3-amino-1-propanosulfónico y 1 µM de hexakis fosfazina (HP-0921; Agilent Technologies) como compuestos de calibración del eje de masa en línea. El volumen de inyección fue de 5 µl, las mediciones se realizaron al azar y en inyecciones dobles. Los espectros de masas se registraron desde m/z 50 hasta m/z 1700 con una frecuencia de 1,4 espectros por segundo durante 0,48 min utilizando configuraciones de alta resolución de 4 GHz. Los ajustes de electropulverización fueron los siguientes: voltaje de pulverización de iones, modo negativo de 3,5 kV; temperatura capilar, 325 ˚C; flujo de gas de secado, 5 l min−1; y 30 psi de presión del nebulizador. Los voltajes de fragmentador, skimmer y octopolo se establecieron en 175, 65 y 750 V, respectivamente.

Se prepararon soluciones madre de 138 compuestos individuales purificados obtenidos de Sigma-Aldrich disolviéndolos por separado en mezclas MilliQ de agua, etanol-agua o metanol-agua, o dimetilsulfóxido y posteriormente se mezclaron a 600 µM (para obtener una lista completa de todos los estándares, consulte Complemento Tabla 1). La mezcla se dividió en alícuotas y se secó a 0,12 mbar hasta que se secó por completo en una configuración SpeedVac (Christ) y se almacenó a -80 °C. Las soluciones de trabajo se prepararon en agua MilliQ con ácido acético al 0,4 % (v/v) y se filtraron antes de su uso.

Las curvas de calibración se obtuvieron a partir de una serie de diluciones en serie de 24 puntos que abarca siete órdenes de magnitud (de 17,9 pM a 150 µM) en agua MilliQ y, para evaluar los efectos de la matriz, en un fondo de muestra de estudio agrupado. Para eso, la matriz diluida se enriqueció con la mezcla estándar diluida en serie. Los estándares se midieron al principio y al final de la medición en modo de ionización positiva y negativa.

Se realizó una regresión lineal de los recuentos de iones transformados logarítmicamente frente a las concentraciones transformadas logarítmicamente en las mediciones de la serie de diluciones estándar, lo que permitió la eliminación iterativa de hasta seis pasos de dilución del límite de concentración superior y 12 puntos de datos de las diluciones inferiores, con la objetivo de maximizar el valor de R2. El límite inferior de cuantificación y el límite superior de linealidad se determinaron como los pasos de dilución aceptados más bajo y más alto, respectivamente. Luego se calcularon las concentraciones de metabolitos en base a las pendientes e intersecciones derivadas. Solo los valores dentro del rango lineal se consideraron para análisis posteriores. De 138 metabolitos, 128 pudieron detectarse y cuantificarse de manera confiable según estos criterios. Para cada metabolito único, medimos hasta cinco modificaciones diferentes (anión desprotonado, catión protonado, catión de aducto de sodio, catión de dímero y catión de aducto de sodio dímero) y seleccionamos manualmente la modificación según el ajuste lineal (valor R2 más alto), el rango lineal y el confiable cobertura dentro del conjunto de datos (número máximo de muestras detectadas). Las modificaciones seleccionadas, los ajustes lineales de los estándares respectivos y el conjunto de datos final se pueden encontrar en la Tabla complementaria 1. Las concentraciones de metabolitos se informan como \(\frac{{\mathrm{{nmol}}}}{{\mathrm{{mg }}\;{\mathrm{muestra}}}}\).

Para los datos de LC-TOF-MS, el preprocesamiento, la selección de picos y la anotación se realizaron con el software MassHunter Quantitative Analysis B.07.00 (Agilent Technologies). Los metabolitos se clasificaron según MetaCyc56 (https://metacyc.org/). Se realizaron más análisis de datos, estadísticas y visualización después de la exportación de datos sin procesar en MATLAB R2021b (MathWorks) utilizando funciones integradas en las cajas de herramientas de Bioinformática y Estadística. Los gráficos, ilustraciones y diagramas se finalizaron con Illustrator (Adobe).

Para cinco ratones SPF, tomamos muestras tanto del moco como del contenido luminal por separado en cinco sitios: duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon. Después de la extracción de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAamp PowerFecal DNA Kit, Qiagen), se prepararon amplicones que abarcaban las regiones variables 3 y 4 del gen 16S rRNA usando los cebadores degenerados 515FY y 806R de acuerdo con los protocolos evaluados para el proyecto Earth Microbiome57,58,59 . Los amplicones amplificados por PCR se purificaron en gel (kit de extracción de gel MinElute, Qiagen) y se agregaron adaptadores de secuenciación y códigos de barras de Illumina, seguido de una limpieza basada en perlas (perlas AMPure, Beckman Coulter). Las muestras se secuenciaron utilizando Illumina MiSeq en el Centro de Genómica Funcional de Zúrich. Un total de 16 557 915 lecturas de secuenciación de 72 muestras (mediana = 173 616) sirvieron como entrada para la inferencia de variantes de secuencia de amplicones (ASV) usando dada2 v.1.14 (ref. 60). Las secuencias de los cebadores (515FY = GTGYCAGCMGCCGCGGTAA, 806R = GGACTACNVGGGTWTCTAAT) se eliminaron con cutadapt v.2.8 (ref. 61) y solo los insertos que contenían ambos cebadores y tenían al menos 75 bases de longitud se guardaron para el análisis posterior. A continuación, las lecturas se filtraron por calidad mediante la función filterAndTrim del paquete dada2 R (maxEE = 2, truncQ = 3, trimRight = (40, 40)). Las funciones learnErrors y dada se usaron para calcular la inferencia de muestra usando pool = pseudo como parámetro. Las lecturas se fusionaron con la función mergePairs y las bimeras se eliminaron con la función removeBimeraDenovo (método = agrupado). Los ASV restantes se anotaron taxonómicamente usando el clasificador IDTAXA62 en combinación con la base de datos Silva v.13863 disponible en http://www2.decipher.codes/Downloads.html. Las muestras con menos de 1000 lecturas (nueve muestras en total) no se consideraron para los análisis posteriores. La tabla de abundancia de ASV resultante se redujo a una profundidad de secuenciación común (6000 lecturas por muestra; es decir, el mínimo de las 63 muestras restantes) para corregir las diferencias en la profundidad de secuenciación entre muestras utilizando la función rrarefy del paquete R vegano. Las tablas de abundancia en cada nivel taxonómico se calcularon sumando la abundancia de ASV pertenecientes a los mismos taxones.

Los análisis estadísticos se realizaron en MATLAB R2021b (MathWorks) utilizando funciones integradas en las cajas de herramientas de Bioinformática y Estadística. Se compararon los valores entre dos grupos (por ejemplo, entre diferentes sitios de muestreo) y se calcularon las significancias estadísticas mediante pruebas t de Student para muestras relacionadas (implementadas en la caja de herramientas Estadísticas de MATLAB). Generalmente, cinco ratones macho sirvieron como réplicas biológicas. Los experimentos no se repitieron. El número exacto de muestras utilizadas para calcular una diferencia estadística se indica en la leyenda de cada figura. La tasa de descubrimiento falso se controló mediante la corrección de los valores de P calculados para pruebas múltiples (procedimiento de Benjamin-Hochberg), y los valores de P corregidos ≤0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Para predecir las abundancias funcionales dentro del microbioma, se utilizó PICRUSt2 v.2.5.1 (ref. 38) en los ASV analizados (Tabla complementaria 10), que produjo una lista de números de clasificación de enzimas para cada microorganismo detectado. A continuación, se reconstruyó la red metabólica del microbioma pronosticada a partir de las listas de clasificación de enzimas y se comparó con la red metabólica de Mus musculus en KEGG utilizando el paquete python bioservices64. Los metabolitos medidos se asignaron a cualquiera de las redes para predecir su origen. Las correlaciones espaciales en todos los sitios de muestra entre microorganismos y metabolitos se calcularon para cada par como el coeficiente de Spearman utilizando el paquete Python Scipy v.1.9.3 (ref. 65).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos LC-TOF-MS sin procesar se han depositado en MassIVE y están disponibles con el código de acceso MSV000091478 (https://doi.org/10.25345/C5K06XB0Q). Los datos de secuenciación del ARNr 16S están disponibles con el ID de BioProyecto PRJNA944604 en el archivo de lectura de secuencias de los NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA944604). La base de datos KEGG se utilizó como recurso en las asociaciones de metabolitos y microbios. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Fan, Y. & Pedersen, O. Microbiota intestinal en la salud y la enfermedad metabólica humana. Nat. Rev. Microbiol. 19, 55–71 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Almeida, A. et al. Un nuevo modelo genómico de la microbiota intestinal humana. Naturaleza 568, 499–504 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wikoff, WR et al. El análisis metabolómico revela grandes efectos de la microflora intestinal en los metabolitos de la sangre de los mamíferos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 106, 3698–3703 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Donaldson, GP, Lee, SM & Mazmanian, SK Biogeografía intestinal de la microbiota bacteriana. Nat. Rev. Microbiol. 14, 20–32 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Spohn, SN & Young, VB en Fisiología del tracto gastrointestinal 6.ª ed. (ed. Said, HM) 737–753 (Academic Press, 2018). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809954-4.00032-3

Kastl, AJ, Terry, NA, Wu, GD & Albenberg, LG La estructura y función de la microbiota del intestino delgado humano: comprensión actual y direcciones futuras. Celúla. mol. Gastroenterol. Hepatol. 9, 33–45 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Quinn, RA et al. El impacto químico global del microbioma incluye nuevas conjugaciones de ácidos biliares. Naturaleza 579, 123–129 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. La capa de moco exterior alberga un nicho microbiano intestinal distinto. Nat. común 6, 8292 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Atuma, C., Strugala, V., Allen, A. & Holm, L. La capa de gel mucoso gastrointestinal adherente: grosor y estado físico in vivo. Soy. J. Physiol. Gastrointestinal. Fisiol hepático. 280, G922–G929 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Desai, MS et al. Una microbiota intestinal privada de fibra dietética degrada la barrera mucosa del colon y aumenta la susceptibilidad a los patógenos. Celda 167, 1339–1353.e21 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopetuso, LR, Scaldaferri, F., Petito, V. & Gasbarrini, A. Comensal Clostridia: principales actores en el mantenimiento de la homeostasis intestinal. Gut Pathog. 5, 23 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Parada Venegas, D. et al. Regulación inmune y epitelial intestinal mediada por ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y su relevancia para las enfermedades inflamatorias del intestino. Frente. inmunol. 10, 277 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Roager, HM & Licht, TR Catabolitos microbianos de triptófano en salud y enfermedad. Nat. común 9, 3294 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Yoshii, K., Hosomi, K., Sawane, K. & Kunisawa, J. Metabolismo de la familia de vitamina B dietética y microbiana en la regulación de la inmunidad del huésped. Frente. Nutrición 6, 48 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Magnúsdóttir, S., Ravcheev, D., de Crécy-Lagard, V. & Thiele, I. La evaluación sistemática del genoma de la biosíntesis de vitamina B sugiere una cooperación entre los microbios intestinales. Frente. Gineta. 6, 148 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Leite, GGS et al. Mapeo de los microbiomas segmentarios en el intestino delgado humano en comparación con las heces: un estudio REIMAGINE. Excavar. Dis. ciencia 65, 2595–2604 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Frame, LA, Costa, E. & Jackson, SA Exploraciones actuales de la nutrición y el microbioma intestinal: una evaluación exhaustiva de la literatura de revisión. Nutrición Rev. 78, 798–812 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Volk, N. & Lacy, B. Anatomía y fisiología del intestino delgado. Gastrointestinal. Endosc. clin. N Am. 27, 1–13 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Han, S. et al. Una tubería de metabolómica para el interrogatorio mecanicista del microbioma intestinal. Naturaleza 595, 415–420 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobson, GP, Letson, HL, Biros, E. & Morris, J. El estado animal libre de patógenos específicos (SPF) como variable en la investigación biomédica: ¿hemos cerrado el círculo? EBioMedicine 41, 42–43 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hugenholtz, F. & de Vos, WM Modelos de ratón para la investigación de la microbiota intestinal humana: una evaluación crítica. Celúla. mol. Ciencias de la vida 75, 149–160 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Smith, CA et al. METLIN: una base de datos de espectros de masas de metabolitos. El r. Monitoreo de drogas 27, 747–751 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nakamura, A., Ooga, T. & Matsumoto, M. La putrescina luminal intestinal es producida por vías biosintéticas colectivas del microbioma comensal. Microbios intestinales 10, 159–171 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Eckburg, PB et al. Diversidad de la flora microbiana intestinal humana. Ciencia 308, 1635–1638 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Jang, C. et al. El intestino delgado convierte la fructosa de la dieta en glucosa y ácidos orgánicos. Metab. celular 27, 351–361.e3 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solopova, A. et al. Biosíntesis y sobreproducción de riboflavina por un derivado del comensal intestinal humano Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697. Frente. Microbiol. 11, 2167 (2020).

Artículo Google Académico

Yamauchi, T. et al. Las especies de bacterias intestinales tienen un impacto distintivo en los metabolitos de purina del huésped durante el envejecimiento en Drosophila. iScience 23, 101477 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wallimann, T., Hall, CHT, Colgan, SP & Glover, LE Suplementos de creatina para pacientes con enfermedades inflamatorias del intestino: una justificación científica para un ensayo clínico. Nutrientes 13, 1429 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P. & Bäckhed, F. De la fibra dietética a la fisiología del huésped: ácidos grasos de cadena corta como metabolitos bacterianos clave. Celda 165, 1332–1345 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Marcobal, A. et al. Una visión metabolómica de cómo la microbiota intestinal humana impacta en el metaboloma del huésped utilizando ratones humanizados y gnotobióticos. ISME J. 7, 1933–1943 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wahlström, A., Sayin, SI, Marschall, H.-U. & Bäckhed, F. Diafonía intestinal entre los ácidos biliares y la microbiota y su impacto en el metabolismo del huésped. Metab. celular 24, 41–50 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Sridharan, GV et al. Predicción y cuantificación de metabolitos de microbiota bioactivos en el intestino del ratón. Nat. común 5, 5492 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Matsumoto, M. et al. Impacto de la microbiota intestinal en el metaboloma luminal intestinal. ciencia Rep. 2, 233 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Donaldson, GP, Lee, SM & Mazmanian, SK Biogeografía intestinal de la microbiota bacteriana. Nat. Rev. Microbiol. 14, 20–32 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Turer, E. et al. La creatina mantiene la homeostasis intestinal y protege contra la colitis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 114, E1273–E1281 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ríos-Covian, D. et al. Una descripción general de los ácidos grasos de cadena corta ramificados fecales a lo largo de la vida humana y su relación con el índice de masa corporal: factores dietéticos y antropométricos asociados. Frente. Microbiol. 11, 973 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Fuhrer, T., Heer, D., Begemann, B. y Zamboni, N. Perfilado preciso y de alto rendimiento del metaboloma de masas de extractos celulares mediante espectrometría de masas de inyección de flujo y tiempo de vuelo. Anal. química 83, 7074–7080 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Douglas, GM et al. PICRUSt2 para la predicción de funciones del metagenoma. Nat. Biotecnología. 38, 685–688 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vacca, M. et al. El controvertido papel del intestino humano Lachnospiraceae. Microorganismos 8, 573 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yasuda, K. et al. Biogeografía de la mucosa intestinal y el microbioma luminal en el macaco rhesus. Microbio huésped celular 17, 385–391 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Timmons, J. Poliaminas y homeostasis de la mucosa intestinal. J. Gastrointestinal. Excavar. sist. 2 (Suplemento 7), 001 (2013).

Google Académico

Mantziari, A., Mannila, E., Collado, MC, Salminen, S. & Gómez-Gallego, C. Las poliaminas exógenas influyen en la adhesión microbiana in vitro al moco humano según la edad del donante de moco. Microorganismos 9, 1239 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferraris, RP, Choe, J. & Patel, CR Absorción intestinal de fructosa. año Rev. Nutr. 38, 41–67 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Konopelski, P. & Ufnal, M. Indoles: metabolitos de triptófano en bacterias intestinales con potencial farmacoterapéutico. actual Metab de drogas 19, 883–890 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chimerel, C. et al. El metabolito bacteriano indol modula la secreción de incretina de las células L enteroendocrinas intestinales. Rep. celular 9, 1202–1208 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rothhammer, V. & Quintana, FJ El receptor de hidrocarburo de arilo: un sensor ambiental que integra las respuestas inmunitarias en la salud y la enfermedad. Nat. Rev. Inmunol. 19, 184–197 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Consorcio Tabula Sapiens et al. La Tabula Sapiens: un atlas transcriptómico de humanos de múltiples órganos y una sola célula. Ciencia 376, eabl4896 (2022).

Tian, L. et al. Descifrando la redundancia funcional en el microbioma humano. Nat. común 11, 6217 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer, RK, Bime, MA & Duca, FA El análisis de metabolómica del intestino delgado revela perfiles de metabolitos regulados diferencialmente en ratas obesas y con suplementos prebióticos. Metabolómica 18, 60 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Reese, AT et al. Limitación de nitrógeno microbiano en el intestino grueso de los mamíferos. Nat. Microbiol. 3, 1441–1450 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Glover, LE et al. El control del metabolismo de la creatina por HIF es un mecanismo endógeno de regulación de barrera en la colitis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 110, 19820–19825 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Šarenac, TM & Mikov, M. Síntesis de ácidos biliares: de la naturaleza a la modificación y síntesis química y sus aplicaciones como fármacos y nutrientes. Frente. Farmacol. 9, 939 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sayin, SI et al. La microbiota intestinal regula el metabolismo de los ácidos biliares al reducir los niveles de ácido tauro-beta-muricólico, un antagonista natural de FXR. Metab. celular 17, 225–235 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Schmidt, F. et al. Evaluación no invasiva de la función intestinal utilizando células centinela de registro transcripcional. Ciencia 376, eabm6038 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Padmanabhan, P., Grosse, J., Asad, ABMA, Radda, GK y Golay, X. Mediciones del tránsito gastrointestinal en ratones con carbón activado marcado con 99mTc-DTPA utilizando NanoSPECT-CT. EJNMMI Res. 3, 60 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Caspi, R. et al. La base de datos MetaCyc de rutas metabólicas y enzimas: una actualización de 2019. Ácidos Nucleicos Res. 48, D445–D453 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Parada, AE, Needham, DM y Fuhrman, JA Todas las bases son importantes: evaluación de cebadores de ARNr de subunidades pequeñas para microbiomas marinos con comunidades simuladas, series temporales y muestras de campo globales. Reinar. Microbiol. 18, 1403–1414 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Apprill, A., McNally, S., Parsons, R. y Weber, L. La revisión menor del cebador del gen SSU rRNA 806R de la región V4 aumenta en gran medida la detección del bacterioplancton SAR11. agua Microbio. Ecol. 75, 129–137 (2015).

Artículo Google Académico

Walters, W. et al. Cebadores mejorados del gen 16S rRNA bacteriano (V4 y V4-5) y del gen marcador espaciador transcrito interno fúngico para encuestas de comunidades microbianas. mSystems 1, e00009–e00015 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Callahan, BJ et al. DADA2: inferencia de muestra de alta resolución a partir de datos de amplicón de Illumina. Nat. Métodos 13, 581–583 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, M. Cutadapt elimina secuencias adaptadoras de lecturas de secuenciación de alto rendimiento. EMBnet. J. 17, 10-12 (2011).

Artículo Google Académico

Murali, A., Bhargava, A. & Wright, ES IDTAXA: un enfoque novedoso para la clasificación taxonómica precisa de secuencias de microbiomas. Microbioma 6, 140 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Quast, C. et al. El proyecto de base de datos de genes de ARN ribosomal SILVA: procesamiento de datos mejorado y herramientas basadas en la web. Ácidos Nucleicos Res. 41, D590–D596 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cokelaer, T., Pultz, D., Harder, LM, Serra-Musach, J. & Saez-Rodriguez, J. BioServices: un paquete común de Python para acceder a servicios web biológicos mediante programación. Bioinformática 29, 3241–3242 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Virtanen, P. et al. SciPy 1.0: algoritmos fundamentales para la computación científica en Python. Nat. Métodos 17, 261–272 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Aguiar Vallim, TQ, Tarling, EJ y Edwards, PA Funciones pleiotrópicas de los ácidos biliares en el metabolismo. Metab. celular 17, 657–669 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a GS Guiral por su asistencia en el procesamiento de datos de secuenciación y el suministro de información específica del método. Agradecemos a A. Othman y K. Ortmayr por su ayuda y soporte para configurar el flujo de trabajo de metabolómica. Se reconoce la financiación parcial del Instituto Nacional de Salud RO1 (GM117324) para EE. UU., la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (SNSF Sinergia CRSII5_177164) para EE. UU. y AJM, y el programa ETH Fellows (Fundación ETH Zurich) para JT.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zúrich.

Instituto de Biología de Sistemas Moleculares, ETH Zürich, Zürich, Suiza

Karin HU Meier, Julian Trouillon, Tobias Fuhrer, Nicola Zamboni y Uwe Sauer

Departamento de Medicina y Cirugía Visceral, Inselspital, Hospital Universitario de Berna, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Hai Li y Andrew J. Macpherson

Instituto de Microbiología, ETH Zürich, Zürich, Suiza

Melanie Lang y Shinichi Sunagawa

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

US y AJM conceptualizaron el proyecto. KHUM configuró el flujo de trabajo de LC-TOF-MS, realizó metabolómica y preparación de muestras de secuenciación 16S, incluida la extracción de metabolitos, ADN genómico y preparación de amplicón 16S, mediciones de metabolómica, procesamiento de datos de metabolómica, análisis de datos de secuenciación y metabolómica, incluida la escritura de código, y preparó y visualizó todos los datos de metabolómica y secuenciación. JT realizó un análisis de coocurrencia de metabolitos y microbios. HL realizó experimentos con ratones, con la ayuda de KHUMML procesó datos de secuenciación sin procesar y brindó apoyo para el análisis. TF y NZ brindaron apoyo y orientación en la planificación del proyecto, mediciones y comentarios al manuscrito. SS y AJM proporcionaron comentarios al manuscrito. KHUM y US escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Uwe Sauer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Metabolism agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Ashley Castellanos-Jankiewicz, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a – Esquema que describe los 15 sitios de muestreo utilizados en este estudio: un sitio en el estómago, 10 sitios en el intestino delgado (tres en el duodeno, cuatro en el yeyuno y tres en el íleon) y cuatro sitios en el intestino grueso ( en el ciego y en el colon ascendente, transverso y descendente). b – Reparto de las clases químicas de MetaCyc entre los 128 metabolitos medidos con nuestro método LC-TOF-MS utilizado en este estudio (Tabla complementaria ST1). c – Análisis de agrupamiento jerárquico de la abundancia de metabolitos del moco intestinal de ratones SPF macho. Las abundancias de los 128 metabolitos cuantificados se muestran como puntuaciones z de concentraciones normalizadas promediadas de cinco ratones, en los 15 sitios de muestreo. El agrupamiento se realizó en base a distancias euclidianas en muestras luminales (Fig. 1a) y dio como resultado la identificación de tres grupos principales, correspondientes a las tres principales regiones fisiológicas conocidas del tracto digestivo, a saber, estómago, intestino delgado y grueso. En este mapa de calor aquí, los metabolitos a lo largo del eje y se ordenan de acuerdo con el orden de la Fig. 1a, para comparar. Los metabolitos en los tres grupos principales están codificados por colores de acuerdo con MetaCyc (como en S1b; Tabla complementaria ST1). d – Concentraciones de metabolitos de arginina, ornitina y espermidina en contenido luminal SPF y muestras de moco del intestino grueso. Se trazan 20 puntos de datos (cuatro sitios del intestino grueso, cinco ratones macho), los diagramas de caja muestran la concentración mediana de metabolitos con una marca más gruesa, los percentiles 25 y 75 se indican mediante el cuadro y los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos que no se consideran valores atípicos.

Datos fuente

a, b: análisis de agrupamiento jerárquico de la abundancia de metabolitos de 10 muestras de contenido luminal (a) y moco (b) del intestino delgado de ratones SPF macho. Las abundancias de 128 metabolitos se muestran como puntuaciones z de concentraciones normalizadas promediadas de cinco ratones macho y tres muestras de duodeno, cuatro de yeyuno o tres de íleon, respectivamente. El agrupamiento jerárquico se realizó en base a estos tres valores promedio (duodeno, yeyuno, íleon). Los metabolitos que cambian significativamente están marcados con recuadros y asteriscos (valor p ≤ 0,05). Los valores de p se calcularon utilizando una prueba t de Student de muestra pareada de dos caras y se pueden encontrar en la Tabla complementaria ST4. La clave de color del mapa de calor indica una abundancia relativa baja a alta de metabolitos en todo el intestino delgado. c – Distribución de concentraciones pico en contenido luminal (arriba) y moco (abajo) intestino delgado, con respecto a las tres regiones. Tres barras indican las tres regiones duodeno, yeyuno e íleon, el eje y muestra la frecuencia de las concentraciones máximas de metabolitos que ocurren en la región respectiva. Abreviaturas: dúo - duodeno, jej - yeyuno e ile - íleon.

Datos fuente

a, b: análisis de agrupamiento jerárquico de la abundancia de metabolitos de cuatro muestras de contenido luminal (a) y moco (b) del intestino grueso en ratones SPF macho. Las abundancias de 128 metabolitos se muestran como puntuaciones z de concentraciones normalizadas promediadas de cinco ratones macho por sitio de muestreo en el colon (ciego, colon ascendente, transverso y descendente). La agrupación jerárquica se realizó solo en estos cuatro valores. Los metabolitos que cambian significativamente están marcados con recuadros y asteriscos (valor p ≤ 0,05). Los valores de p se calcularon usando una prueba t de Student de muestras pareadas bilaterales. La clave de color del mapa de calor indica una abundancia relativa baja a alta de metabolitos en todo el intestino grueso. c – Se representa la distribución de las concentraciones máximas en el contenido luminal (arriba) y la mucosidad (abajo) del intestino grueso, con respecto a las cuatro regiones. Cuatro barras indican las regiones, el eje y muestra la frecuencia de las concentraciones máximas de metabolitos que se producen en la región respectiva. Abreviaturas: cec: ciego, acol: colon ascendente, tcol: colon transverso y dcol: colon descendente.

Datos fuente

a – Distribución de los cambios en la concentración de metabolitos en el SPF frente a la comparación libre de gérmenes en el contenido luminal y las muestras de moco. Los cambios de pliegue se calculan por metabolito en el hábitat respectivo para cinco ratones macho y 15 sitios de muestreo, log2 transformados, y su distribución se muestra como un gráfico de contorno a lo largo del eje x. La frecuencia se denota en el eje y. Un cambio de log2 negativo indica una mayor concentración de metabolitos en ratones libres de gérmenes, un cambio de log2 positivo indica una mayor concentración en ratones SPF macho. En gris, todos los cambios de pliegue absolutos ≤ 2 están marcados. b – Concentración del intestino grueso de adenosina, 3-hidroxibutirato, fucosa/ramnosa y caproato en SPF y contenido luminal libre de gérmenes y moco. Las barras sólidas muestran la concentración media de las mediciones de cinco ratones macho, promediadas en los cuatro sitios del intestino grueso. Los 20 puntos de datos correspondientes se muestran como círculos. Abreviaturas: FC – cambio de pliegue; GF – libre de gérmenes; dúo - duodeno, jej - yeyuno e íle - íleon; cont – contenido lumínico; moco - moco.

Datos fuente

a - Cambios de pliegue transformados en Log2 de la concentración media en el intestino delgado de 42 metabolitos con patrones longitudinales en el intestino delgado (consulte la Fig. 3 para ver perfiles de ejemplo, Fig. 5, Tabla complementaria ST4). Se calcularon los cambios de pliegue entre muestras SPF masculinas y libres de gérmenes masculinos en contenido luminal (panel izquierdo) y moco (panel derecho), promediados en los 10 sitios de muestreo y cinco réplicas biológicas. Los diagramas de caja se basan, por lo tanto, en 50 puntos de datos, donde el cambio de pliegue log2 mediano se indica en azul, los percentiles 25 y 75 se indican mediante el cuadro, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos que no se consideran valores atípicos, y los valores atípicos se marcan con el símbolo más . El área gris representa cambios absolutos de log2 veces ≤ 2. b – Perfiles de metabolitos espaciales de contenido luminal o concentraciones de moco en ratones SPF y libres de gérmenes. Las líneas con área sombreada indican el promedio móvil de la media ± sem de mediciones de concentración con cinco ratones macho. Abreviaturas: FC – cambio de pliegue; GF – libre de gérmenes; duo – duodeno, jej – yeyuno, ile – íleon, cec – ciego y col – colon.

Datos fuente

Composición de la comunidad y diferencias en todo el intestino del contenido luminal de SPF masculino (panel superior) y moco (panel inferior) en cinco sitios: duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon. Se muestran las abundancias relativas de microbios en porcentaje, a nivel de familia. El 95% superior de los miembros de la comunidad anotados por muestra se muestran discretamente, las categorías bacterianas que representan menos del 5% de la comunidad se agrupan en "otros".

Datos fuente

Las tablas complementarias 1–10 combinadas en un solo libro de trabajo con diez pestañas separadas. Los datos incluyen información detallada sobre las moléculas, cambios de plegado específicos, valores de P y otra información que respalda el texto principal y las figuras.

Datos de metabolitos procesados y cuantificados por muestra.

Datos de abundancia de metabolitos, puntajes del análisis de componentes principales (PC1 y PC2), datos de fuentes estadísticas (valores P y cambios de pliegue).

Fuente de datos estadísticos (valores P y cambios de pliegue), datos de concentración de metabolitos.

Datos de concentración de metabolitos.

Fuente de datos estadísticos (valores P y cambios de pliegue), datos de concentración de metabolitos.

Identificadores KEGG, datos de fuentes estadísticas, datos de concentración de metabolitos.

Datos de abundancia de metabolitos, datos de concentración de metabolitos.

Datos de concentración de metabolitos.

Datos de fuente estadística, datos de concentración de metabolitos.

Fuente de datos estadísticos (valores p y cambios de pliegue), datos de concentración de metabolitos.

Datos de abundancia microbiana.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Meier, KHU, Trouillon, J., Li, H. et al. El paisaje metabólico del intestino del ratón macho identifica diferentes nichos determinados por actividades microbianas. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

Descargar cita

Recibido: 28 junio 2022

Aceptado: 06 abril 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt