La microglía humana muestra cambios transcripcionales únicos en la enfermedad de Alzheimer

Envejecimiento natural (2023)Citar este artículo

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La microglía, las células inmunitarias innatas del cerebro, influyen en la progresión de la enfermedad de Alzheimer (EA) y son objetivos terapéuticos potenciales. Sin embargo, la microglía exhibe diversas funciones, cuya regulación no se comprende completamente, lo que complica el desarrollo de terapias. Para definir mejor los fenotipos transcriptómicos y las redes reguladoras de genes asociadas con la EA, enriquecimos los núcleos de microglía de 12 EA y 10 cortezas prefrontales dorsolaterales humanas de control (7 hombres y 15 mujeres, todos mayores de 60 años) antes de la secuenciación de ARN de un solo núcleo. Aquí describimos los fenotipos moleculares microgliales establecidos y previamente no reconocidos, las redes de genes inferidas que impulsan el cambio transcriptómico observado y aplicamos el análisis de trayectoria para revelar las supuestas relaciones entre los fenotipos microgliales. Identificamos fenotipos microgliales más prevalentes en casos de EA en comparación con los controles. Además, describimos la heterogeneidad en los subgrupos de microglia que expresan marcadores homeostáticos. Nuestro estudio demuestra que el perfilado profundo de la microglía en el cerebro humano con EA puede proporcionar información sobre los cambios transcripcionales microgliales asociados con la EA.

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza patológicamente por placas extracelulares de beta amiloide (Aβ), ovillos neurofibrilares intracelulares neuronales y neuroinflamación. El interés en la neuroinflamación como una característica modificable de la patología de la EA ha crecido junto con estudios genéticos que identifican variantes de riesgo de EA localizadas en regiones codificantes y no codificantes de genes expresados de manera única por células mieloides cerebrales1. La microglía son células mieloides inmunes innatas residentes del cerebro y contribuyen a los procesos neuroinflamatorios hipotéticos para promover la fisiopatología de la EA2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estudios previos sugirieron que, en la EA, la microglía libera mediadores inflamatorios que influyen en el comportamiento y la función de las neuronas circundantes, y la glía pierde funciones neuroprotectoras e inicia una fagocitosis aberrante de sinapsis y neuronas3,7,11,12. La microglía parece contribuir a la propagación de tau en los sistemas modelo13,14 y es probable que sea el tipo de célula principal involucrado en la eliminación de Aβ, incluida la reducción de Aβ observada en respuesta a los enfoques de inmunoterapia basados en anticuerpos15. Como tal, los comportamientos inflamatorios de la microglía son relevantes para el diseño de dianas terapéuticas. Sin embargo, quedan grandes lagunas en nuestra comprensión de las respuestas de la microglía en el cerebro con AD.

Los fenotipos de microglía se diferencian por morfología, fisiología y patrones de expresión de genes o proteínas. Los experimentos realizados en sistemas modelo sugieren que es probable que estas características heterogéneas se asocien con fenotipos funcionales específicos de microglía10,16,17,18,19,20,21. Se sabe menos sobre la heterogeneidad de los fenotipos de microglía dentro del cerebro humano adulto, especialmente en el contexto de estados patológicos específicos, como la EA. Los estudios de secuenciación de ARN de una sola célula y un solo núcleo (snRNA-seq) de tejido cortical humano fresco y congelado han revelado múltiples fenotipos transcripcionales de microglía en el contexto de la EA y otras patologías cerebrales22,23,24,25,26,27,28, 29 La distinción de grupos transcriptómicamente distintos permite la identificación de factores genéticos y epigenéticos candidatos que regulan comportamientos celulares específicos, que podrían aprovecharse en enfoques terapéuticos de precisión. Sin embargo, los métodos estándar de snRNA-seq a menudo incluyen pequeñas cantidades de microglía por individuo. Un número bajo de células puede disminuir la capacidad de mapear la gama completa de fenotipos transcripcionales microgliales y limitar la capacidad para identificar cambios en la expresión génica asociados a enfermedades dentro de un grupo o subgrupo. Presumimos que los procesos celulares adicionales y los factores reguladores de los fenotipos transcripcionales de microglia se descubrirían mediante el uso de conjuntos de datos que contienen cantidades mucho mayores de microglia por muestra individual.

Empleamos la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) para PU.1 como una técnica de enriquecimiento de microglía para snRNA-seq. El marcador mieloide PU.1 se ha utilizado para mejorar la investigación de la epigenética de la microglía mediante el ensayo de cromatina accesible por transposasa mediante secuenciación30 y, en el presente estudio, se aplicó a la secuenciación de ARN (RNA-seq). Este enfoque facilitó la adquisición de perfiles transcriptómicos de un solo núcleo de miles de microglia por sujeto. Generamos perfiles transcripcionales de microglia a partir de una cohorte de 22 individuos con y sin AD, lo que nos permitió anotar grupos de microglia con funciones biológicas plausibles e identificar diferencias en la microglia entre AD e individuos de control. La gran cantidad de perfiles en este conjunto de datos también nos permitió identificar subgrupos específicos de EA dentro del grupo de microglía, típicamente anotados como "homeostáticos" según su perfil de expresión génica22,25,26,29. Además de los fenotipos homeostáticos e inflamatorios descritos en informes anteriores, descubrimos fenotipos microgliales con perfiles transcriptómicos que pueden brindar información adicional sobre la patogénesis de la EA. Estos hallazgos brindan nuevas vías para probar hipótesis en futuros estudios sobre los roles de la microglía en la EA.

Enriquecimos núcleos aislados de cerebro humano post mórtem para microglía usando FANS para la expresión del factor de transcripción específico de mieloide PU.1 (Datos extendidos Fig. 1a, b). Para confirmar que PU.1 FANS fue efectivo, aislamos y secuenciamos núcleos con y sin PU.1 FANS (n = 4). Analizamos números similares de núcleos totales en los conjuntos de datos sin clasificar (46,085; datos extendidos Fig. 1c) y PU.1 ordenados (41,488; datos extendidos Fig. 1d). El conjunto de datos ordenados PU.1 contenía 20 veces más núcleos de microglia definidos por una alta expresión de C3, CD74, C1QB, CX3CR1 y SPI1 (23 310 núcleos de microglia) que el conjunto de datos sin clasificar (1032 núcleos de microglia). Los núcleos de microglia observados en el conjunto de datos ordenados PU.1 también demuestran una mayor complejidad como lo demuestran más grupos de microglia (Datos extendidos, Fig. 1d).

Luego aplicamos PU.1 FANS a una cohorte de 22 individuos (Fig. 1a). Después de PU.1 FANS, las muestras retienen una variedad de tipos de células no mieloides (Fig. 1b) al tiempo que brindan una resolución clara de grupos que demuestran distintos patrones de expresión génica de microglía (63% de los núcleos; Fig. 1c). El conjunto de datos inicial constaba de 205 226 núcleos, con 200 948 núcleos (98 %) que pasaron el control de calidad y la eliminación de dobletes. La expresión génica de genes marcadores de tipo celular demuestra que los grupos identificados como microglía (1, 2, 3, 7, 16 y 17; Fig. 1d) en el conjunto de datos tienen una alta expresión de marcadores de microglía y no expresan genes marcadores canónicos de otros tipos de células. . Así, de los 200.948 núcleos, 127.371 fueron identificados como microglía (Fig. 1d y Datos ampliados Fig. 2), con una media de 5.790 núcleos por individuo. Este conjunto de datos es el conjunto de datos de microglia por muestra más grande generado hasta el momento, incluso en comparación con otros conjuntos de datos publicados que han utilizado técnicas de enriquecimiento alternativas. Los gráficos detallados de expresión génica tanto de microglía (datos extendidos Fig. 2) como de marcadores de astrocitos o monocitos periféricos (datos extendidos Fig. 3) demuestran una alta expresión de genes de microglía en el conjunto de datos del subconjunto de microglía en todos los subgrupos y la falta de otro tipo de células y periféricos. marcadores

a, Diseño experimental de 22 cortezas prefrontales dorsolaterales humanas post mortem (creadas en parte con BioRender). b, UMAP de los núcleos ordenados PU.1 del conjunto de datos de 22 sujetos demuestra que, aunque están presentes otros tipos de células, incluidas neuronas, astrocitos, oligodendrocitos (Oligs) y sus progenitores (OPC), así como células endoteliales, seis grupos , incluidos los tres más grandes, están compuestos por núcleos de microglía. c, Se muestran genes marcadores de tipo celular representativos (eje x) con el porcentaje de núcleos que expresan un gen (tamaño de punto) en cada grupo (distribuido a lo largo del eje y) y el nivel de expresión promedio (intensidad de color) para microglia (CX3CR1 , C1QB, CD74 y C3), astrocitos (GFAP), neuronas (MAP2), OPC (COL20A1), Oligs (ST18) y células endoteliales (ITIH5) para cada grupo. d, la expresión génica de un conjunto más amplio de genes marcadores de tipo celular demuestra que los grupos 1, 2, 3, 7, 16 y 17 están compuestos por microglía. IHC, inmunohistoquímica.

El análisis de grupos de los 127 371 núcleos con expresión similar a la microglía identificó 10 grupos (Fig. 2a) caracterizados por genes expresados diferencialmente (DEG) que comparan el grupo con todos los demás núcleos (Fig. 2b). Usando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), determinamos el enriquecimiento de las vías biológicas en cada grupo (Fig. 2c). Hubo poca o ninguna superposición en los DEG que definen cada grupo o las vías biológicas identificadas por GSEA, lo que respalda la singularidad de cada grupo.

a, UMAP de agrupamiento imparcial en los núcleos de los seis grupos clasificados PU.1 (1, 2, 3, 7, 16 y 17, que se muestran en la Fig. 1d) que cumplen los criterios para la microglía del conjunto de datos de 22 muestras que contiene 10 grupos de microglía . b, el análisis de expresión diferencial que compara cada grupo con todos los demás grupos demuestra perfiles de expresión génica distintos para cada uno. Los 25 genes principales de cada grupo se muestran con nombres de genes anotados a la derecha. El grupo 1 tiene una alta expresión de genes canónicos de microglía (CX3CR1 y P2RY12). c, el análisis GSEA de los genes que diferencian cada grupo del grupo 1 ("marcador homeostático") sugiere vías biológicas distintas. d, la expresión génica del marcador de microglia canónico en el conjunto de datos de microglia frente a otros tipos de células clasificados durante el enriquecimiento de PU.1 demuestra el enriquecimiento de la expresión del gen marcador de microglia en los 10 grupos. NES, puntuación de enriquecimiento normalizado.

Primero, encontramos grupos con anotaciones similares a los fenotipos de microglia descritos previamente en el cerebro humano. Identificamos el grupo 1, el grupo más grande, como el grupo enriquecido en genes homeostáticos, incluida la alta expresión de CX3CR1 y P2RY12 (refs. 19,24,25,26). Abreviamos este grupo que expresa marcadores homeostáticos como 'HM'. HM se estableció como la base de comparación para evaluar los DEG para otros grupos, replicando el enfoque en publicaciones anteriores22,25,26 (Datos complementarios 1). El grupo 4 se enriqueció con las vías involucradas en la apoptosis, la respuesta al interferón-gamma (IFN-γ) y las funciones respiratorias y mitocondriales (Fig. 2c), incluidas las vías KEGG de la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y Huntington. El DEG más alto en este grupo es FTL. En conjunto, el perfil del grupo 4 sugiere un fenotipo degenerativo o distrófico12,26. El grupo 7 se caracterizó por la expresión de genes involucrados en la migración y la motilidad (Fig. 2b). Las vías enriquecidas en el grupo 7 incluyeron la organización y la motilidad de la membrana (Fig. 2c). El grupo 8 presentaba un fenotipo inflamatorio canónico con expresión de genes clásicos de activación inflamatoria, incluidos NFκB1, RELB e IL1β (Fig. 2b)2,31,32. GSEA reveló que este grupo estaba enriquecido en la señalización de NFκB, la señalización de interferón, la señalización del receptor tipo Toll (TLR) y las vías de señalización mediadas por RIG-I, lo que indica respuestas inflamatorias del efector aguas abajo a los estímulos (Fig. 2c). Los términos adicionales de Gene Ontology (GO) asociados con el grupo 8 incluyeron síntesis y localización de lípidos. El grupo 9 está definido por genes y vías involucrados en la senescencia, la homeostasis del hierro y la producción de citoquinas (Fig. 2b), incluidos CDKN1A, CEBPB, ZFP36 y FTL33. Este perfil es sugestivo de microglía senescente34. El grupo 10 se define por la expresión de genes implicados en la regulación del ciclo celular y la reparación del ADN35,36 (Fig. 2b). Las vías enriquecidas en el grupo 10 confirman el aumento relativo de genes involucrados en los procesos del ciclo celular y una disminución de genes de procesamiento de endosomas y citoquinas (Fig. 2c). Como se esperaba para la microglía de diferentes fenotipos activados y no activados, los genes como P2RY12 variaron en expresión, mientras que los genes de microglía, como C3 y CD74, tenían una representación más similar en los subgrupos de microglía (Fig. 2d).

A continuación, encontramos tres grupos, los grupos 3, 5 y 6, no descritos previamente en el cerebro humano. Estos grupos se distinguieron por su expresión génica de la red endolisosomal (ELN) y el enriquecimiento de las firmas de la vía ELN en relación con la microglía HM. Por lo tanto, los anotamos colectivamente como ELN. El grupo 3 está definido por genes implicados en la internalización de proteínas agregadas (Fig. 2b)19,20,24,25,26,37 fagocitosis y transporte mediado por vesículas32. Las vías enriquecidas en el grupo 3 incluyen vías de endosoma y lisosoma, así como catabolismo y unión a lípidos, pero no procesos inflamatorios (Fig. 2c). Los genes implicados en la glucólisis tienen una expresión más baja en el grupo 3, lo que lo diferencia de los otros dos grupos de ELN, lo que sugiere que estas células no han sufrido el cambio metabólico a la glucólisis observado en el fenotipo inflamatorio de la microglía38. Los grupos 5 y 6 mostraron una firma ELN, aunque también parecían metabólicamente activos con distintas características inflamatorias. El grupo 5 tenía una mayor expresión de HSP90AA1, HIF1A y BAG3 además de otros genes de proteínas de choque térmico (Fig. 2b), lo que sugiere que estas células están respondiendo al estrés externo. Los genes que impulsan la glucólisis también fueron más altos en el grupo 5 en comparación con HM, lo que posiblemente refleja un cambio a la glucólisis en estas células38. Las vías enriquecidas en este grupo indican que es activo en endocitosis, autofagia y mitofagia (Fig. 2c). El grupo 6 se caracteriza por genes de actividad metabólica y vías de respuesta al estrés similares al grupo 5 (Fig. 2c), aunque con un componente adicional de señalización de interferón sugerido por niveles significativamente más altos de IRF3, IRF5 e IRF7. El grupo 6 también mostró una mayor expresión de reconocimiento de ADN/ARN citosólico y genes antivirales, incluidos IFIT2, IFIT3 y TRIM22 (ref. 39), así como el receptor de reconocimiento de patrones CARD9 y mediadores del inflamasoma NLRP331,32,40,41,42 ,43. Es de destacar que, exclusivo del grupo 6, encontramos que los genes de reparación de ADN ATM y RNASEH2B tenían una expresión más baja. Mientras que IL1β aumentó en el grupo 6 en comparación con HM, se encontraron niveles incluso más altos de IL1β y expresión de otras moléculas efectoras inflamatorias, como NFkB1, en el grupo 8, el grupo 'inflamatorio' más canónico. Las vías enriquecidas en el grupo 6 también respaldan las respuestas inflamatorias aguas arriba a los estímulos de patrones moleculares asociados al peligro, como el enriquecimiento en la señalización del receptor similar a NOD (NLR). Además, utilizamos una metodología alternativa para identificar las vías biológicas y los vínculos entre ellas, lo que validó las funciones de ELN de los grupos 3, 5 y 6 (datos extendidos, figura 4). Las tablas complementarias que contienen los genes que impulsan la presencia de cada nodo en la red están disponibles en Synapse.

A pesar del papel de APOE en el riesgo y la progresión de AD44, hasta la fecha ningún estudio ha definido estados de microglía en individuos con un genotipo APOE específico. Debido a que la mayoría (13/22) de nuestras muestras eran homocigotas para el alelo APOE ε3, generamos un subconjunto de nuestro conjunto de datos que consistía en su totalidad en individuos APOE ε3/ε3 (siete controles y seis patología AD, nueve mujeres y cuatro hombres; 75 018 microglia núcleos). Después de volver a normalizar y volver a agrupar, identificamos nueve grupos de microglia (Datos extendidos Fig. 5a). Estos grupos fueron definidos por genes similares a los que definieron los grupos en el conjunto de datos de genotipo APOE mixto (Datos extendidos Fig. 5b y Datos complementarios 2). Descubrimos que, en la mayoría de los grupos, los DEG eran muy similares (~60 % o más de coincidencia) a los del conjunto de datos APOE mixto (datos extendidos, figura 5c). Los grupos de HM, neurodegenerativos, inflamatorios, del ciclo celular y endolisosomales fueron similares a los de la cohorte Mixta APOE. Esto sugiere que la presencia de múltiples grupos de microglía ELN distintos es común en el cerebro humano incluso cuando se controla el genotipo APOE.

Para caracterizar las redes reguladoras de las poblaciones en el conjunto de datos, identificamos las principales redes impulsadas por factores de transcripción (reglones) que controlan la expresión génica en cada uno de los grupos de microglia (Fig. 3). Cada grupo está definido por un conjunto específico de regulones (Fig. 3a), lo que respalda la hipótesis de que la expresión génica diferencial que caracteriza a cada grupo está determinada por mecanismos de regulación transcripcional. Para demostrar la diversidad de regulones predichos para impulsar la expresión génica en diferentes grupos, destacamos el grupo 3, el grupo 5, el grupo 6 y el grupo 8 (Fig. 3b). Cada uno de estos grupos muestra un conjunto diferente de regulones que aparecen como uno de los 10 principales para ese grupo repetidamente en las permutaciones del análisis. Por ejemplo, el grupo 5 comparte un fenotipo glucolítico y endolisosomal con el grupo 6, pero no comparte los regulones del factor de respuesta de interferón previstos para el grupo 6. Además, mientras observamos los regulones IRF1 y NFKB2 en el grupo 8, el grupo efector 'inflamatorio' canónico, observamos regulones de factor de respuesta de interferón adicionales (y diferentes) en el grupo 6. Los regulones superiores para otros grupos también difieren entre sí (Datos extendidos Fig. 6). MAFB, un factor de transcripción asociado con la regulación de genes antiinflamatorios, encabezó la lista en el grupo 3 (ref. 16). Por el contrario, los regulones dirigidos por factores de transcripción típicamente asociados con respuestas antivirales, IRF7 y, en menor medida, IRF3, encabezaron la lista en el grupo 6, lo que concuerda con la observación de que estas células también están enriquecidas para el reconocimiento de ácidos nucleicos y las vías endolisosomales. Figura 3b). Los regulones superiores para el subconjunto de individuos APOE ε3/ε3 demuestran una diversidad única similar a la descrita en el conjunto de datos más grande, lo que nuevamente sugiere homología entre los genotipos APOE (Datos extendidos Fig. 7). Juntas, estas redes de genes inferidas y sus regulones de factores de transcripción demuestran la diversidad de los grupos identificados aquí y proporcionan objetivos regulatorios potenciales para investigar en estudios futuros.

a, el flujo de trabajo SCENIC identificó redes reguladas por factores de transcripción asociadas con diferentes grupos fenotípicos de microglía. Mapa de calor del área bajo la curva (AUC) del factor de transcripción (actividad del regulón en grupos). b, Porcentaje de casos en los que los regulones del factor de transcripción se encontraban entre las 10 puntuaciones de especificidad de regulón superiores por grupo (de 27 permutaciones). El color más oscuro indica un mayor porcentaje de replicación.

Los experimentos en sistemas modelo con estímulos definidos han demostrado el potencial de la microglía para adquirir diversos fenotipos. Sin embargo, comprender la progresión y los cambios fenotípicos adquiridos por la microglía humana in vivo es un desafío. Empleamos nuestro conjunto de datos de núcleo único para investigar las transiciones transcriptómicas de microglía utilizando el método de inferencia de trayectoria Monocle3 (ref. 45) (Fig. 4). Preguntamos qué grupo puede ser el estado final versus el estado de transición como un ejercicio de generación de hipótesis. Las trayectorias de ramificación resultantes sugieren que múltiples estados de transición irradian desde HM, el grupo enriquecido para la expresión de genes homeostáticos, lo que respalda la hipótesis de que la microglía 'homeostática' puede pasar a múltiples fenotipos de punto final en humanos como lo predicen los estudios modelo10,16,17. Encontramos relaciones entre grupos que no eran evidentes de inmediato al explorar DEG y GSEA solos. El análisis de la trayectoria reveló un punto de ramificación donde la progresión celular continúa hacia el grupo ELN de estrés autofágico (grupo 5) o el ELN inflamatorio, grupo 6 (Fig. 4). El grupo 5 es adyacente al grupo similar a la senescencia (grupo 9), de acuerdo con la noción de que la autofagia y la senescencia son vías y puntos finales biológicos relacionados. Similar al trabajo de Nguyen et al.26, el grupo móvil (grupo 7) es otro criterio de valoración.

La inferencia de la trayectoria del monóculo aplicada al conjunto de datos de microglía demuestra que múltiples opciones fenotípicas irradian hacia afuera desde el grupo 1. Cada rama tiene varios puntos finales potenciales, lo que sugiere que la microglía puede no progresar a lo largo de una trayectoria lineal de una sola etapa, sino que, en cambio, avanza a través de uno de varios estados de transición para alcanzar varios fenotipos finales transcriptómicos.

Tanto los grupos inflamatorios canónicos como los que expresan marcadores homeostáticos (HM y grupo 8, respectivamente) estaban representados por igual tanto por AD como por cerebro de control. Por el contrario, encontramos que el grupo 6 tenía más núcleos de AD de los que cabría esperar en nuestro conjunto de datos (P ajustado = 0,006), lo que sugiere que los procesos relevantes para AD pueden estar representados en el perfil de este grupo (Fig. 5a). Múltiples estudios de asociación del genoma completo de la EA han identificado alelos de riesgo asociados con genes expresados en microglía o células mieloides4. Usando una lista de 46 genes en locus de polimorfismo de un solo nucleótido asociados con el riesgo de EA alterado44,46, usamos GSEA para evaluar el enriquecimiento de estos genes en los 10 grupos de microglía identificados. Observamos que más genes de riesgo de AD se expresan diferencialmente en el grupo 6 (Fig. 5b) en comparación con todos los demás grupos (P ajustado <0.001). La expresión génica de PICALM, SORL1 y PLCG2 fue significativamente menor en el grupo 6 en comparación con el resto de los grupos, mientras que otros genes, incluidos APP, APOE y BIN1, tuvieron una expresión significativamente mayor (todos ajustados P <0.001; Fig. 5b). Usando un conjunto alternativo de genes ELN, demostramos una expresión diferencial significativa en el grupo 6, mientras que los genes asociados a TLR se expresaron más a menudo en el grupo 8 (Datos extendidos Fig. 8a, b). Los genes asociados con la 'microglía asociada a la enfermedad' se enriquecieron en múltiples grupos, en contraste con un solo grupo observado en modelos de ratones con AD19 (Datos extendidos Fig. 8c). Investigamos más a fondo si un fenotipo de microglía presente en el envejecimiento saludable se redujo en el cerebro con AD. Determinamos que el grupo 10, el grupo que expresa diferencialmente los genes reguladores del ciclo celular, es más grande en el cerebro de control en comparación con el cerebro con AD (APOE mixto ajustado P <0.001 y APOE ε3 / ε3 ajustado P <0.001; Fig. 5a). El grupo 10 es el grupo más pequeño de nuestro conjunto de datos y, por lo tanto, merece replicación; sin embargo, estos datos sugieren que la patología de la EA puede implicar una reducción detectable en un grupo de microglia enriquecido para el ciclo celular y los genes de reparación del ADN.

a, el grupo 6 aumenta significativamente en el cerebro con AD (FDR corregido por chi-cuadrado P = 0,0064), mientras que el grupo 10 aumenta en las muestras de control (Ctrl) (FDR corregido por chi-cuadrado P = 0,0006). b, El mapa de calor de la expresión del gen de riesgo asociado con la EA en los grupos de microglía muestra una expresión diferencial más fuerte en el grupo 6. c, Demostración de la heterogeneidad de la morfología del lisosoma en la microglía. Las imágenes representativas de un caso de AD muestran microglía (Iba-1, verde) con heterogeneidad en la morfología y la señal de Lamp-1. Los ejemplos son una señal de lisosoma ramificado (flecha superior) y mayor (Lamp-1, magenta) y un fenotipo "activado" o menos ramificado (flecha inferior). d, Microglía representativa (Iba-1, verde) con alta expresión de PTGDS (rojo), un marcador del grupo 6 en un caso de AD. e, Microglía representativa (Iba-1, verde) con alta expresión de P2RX7 (magenta), un marcador del grupo 6 en un caso de AD. f, Un ejemplo representativo de microglía activada con un gran número de lisosomas (Lamp-1, blanco) y dsDNA citosólico (magenta) en un caso de AD. Todas las imágenes representativas en c–f muestran tinción replicada en múltiples campos y al menos tres cerebros humanos. Todas las barras de escala representan 15 µm. **P corregida < 0,01.

Los datos transcriptómicos predicen la heterogeneidad en los fenotipos endolisosomales de la microglía tanto en el control envejecido como en el cerebro con EA. La inmunotinción para LAMP1, un marcador lisosomal, reveló un espectro de fenotipos lisosomales con diferentes tamaños y números lisosomales (Fig. 5c). Los marcadores del grupo 6 que expresan microglia se identificaron en el cerebro con AD mediante inmunomarcaje para los productos proteicos de PTGDS (Fig. 5d) y P2RX7 (Fig. 5e), ambos genes altamente expresados en ese subgrupo. Las microglías del grupo 6 y del grupo 8 demuestran expresión diferencial de genes implicados en la detección de moléculas de ADN/ARN, lo que sugiere que la microglía puede activarse por exposición a ácidos nucleicos citosólicos. Para evaluar la presencia de ácidos nucleicos citosólicos en la microglía, inmunomarcamos la microglía para ADN de doble cadena (dsDNA) (Fig. 5d). Observamos que la microglía con inmunorreactividad para dsDNA también contenía lisosomas agrandados, mientras que otra microglía en la misma sección de tejido tenía un tamaño de lisosoma normal y no tenía inmunoreactividad para dsDNA (Datos extendidos Fig. 9). Estos hallazgos sugieren que la heterogeneidad de la microglía reflejada por los patrones de expresión génica puede representar fenotipos morfológicos que pueden detectarse en tejido humano.

Pensamos que, dados los cambios inflamatorios conocidos asociados con los perfiles moleculares del cerebro humano, podría ser un desafío detectar firmas específicas de EA al estudiar subpoblaciones polarizadas en EA y tejido cerebral envejecido. Dirigimos nuestra atención a la complejidad dentro de HM. Como se informó anteriormente, observamos que HM es la población más grande y proporcionalmente similar en AD y muestras de cerebro de control envejecidas22,25,26. Esta población no ha sido ampliamente caracterizada para comprender el impacto de la EA en la expresión génica dentro de la microglía homeostática. Nuestro conjunto de datos estudió más de 50 000 microglías enriquecidas con marcadores homeostáticos, lo que permitió la detección de subgrupos dentro de la población de microglías HM. La subagrupación de microglia HM reveló siete poblaciones con expresión génica diferencial (Fig. 6a). Descubrimos que, en contraste con el conjunto de datos de microglia más grande, había un subgrupo casi único para los casos de AD. Este subgrupo de microglia específico de AD, subgrupo 1.5 (Fig. 6b), estaba compuesto casi exclusivamente por microglia de AD, lo que sugiere que puede estar impulsado únicamente por la patología de AD (P ajustado <0,001). Por el contrario, el subgrupo 1.4 estuvo sobrerrepresentado por los núcleos de control (Fig. 6b; P ajustado <0.05). Los subgrupos de HM mostraron una alta expresión de P2RY12, con la expresión más alta en el subgrupo 1.5 (Fig. 6c). Otros marcadores de expresión génica del subgrupo 1.5 de HM fueron más específicos, incluidos los DEG WIPF3, PDE4B y KCNIP (Fig. 6c). Para comenzar a caracterizar los supuestos procesos biológicos representados en estos subgrupos, realizamos GSEA como se indicó anteriormente. El subgrupo 1.5 tenía un perfil único de enriquecimiento de genes involucrados en la motilidad celular y la señalización de calcio (Fig. 6d). Usando inmunohistoquímica, validamos la presencia de alta expresión de proteína P2RY12 y PDE4B positiva doble en microglía en el cerebro humano con AD (Fig. 6e). Además, verificamos estos resultados en nuestra cohorte de todos los individuos APOE ε3/ε3. Confirmamos que, nuevamente, el grupo de microglia enriquecido para la expresión génica homeostática podría dividirse en múltiples poblaciones con expresión génica distinta y que uno de esos grupos se enriqueció en casos de AD (Datos extendidos, Fig. 10).

a, La subagrupación del marcador homeostático microglia (HM) del grupo 1 reveló siete subpoblaciones definidas por la expresión génica diferencial. b, el subgrupo 1.5 se expande en gran medida en las muestras de cerebro con AD (FDR corregido por chi-cuadrado P = 6.2936 × 10−13), mientras que el subgrupo 1.4 se incrementa en las muestras de cerebro de control (Ctrl) (FDR corregido por chi-cuadrado P = 0.0194) . c, La expresión génica de P2RY12 demuestra una alta expresión en los subgrupos de HM, con la expresión más alta en el subgrupo 1.5. Los genes expresados diferencialmente en el subgrupo 1.5, como WIPF3, PDE4B y KCNIP, también demuestran una alta expresión. d, el enriquecimiento de la ruta en el subgrupo 1.5 demuestra un enriquecimiento único para la motilidad, la actividad del canal iónico y los procesos relacionados con las neuronas. e, La inmunohistoquímica valida la presencia de microglía doblemente positiva con alta expresión de P2RY12 y expresión de PDE4B en el cerebro con AD. Imágenes representativas muestran tinción replicada en múltiples campos y al menos tres cerebros humanos. Barras de escala, 25 µm. *P corregido < 0,05; **P corregida < 0,01. Reg., reglamento.

Este estudio identificó 10 grupos de microglia distintos del cerebro humano envejecido. Estos incluyeron fenotipos transcripcionales homeostáticos, senescentes e inflamatorios de microglía descritos anteriormente, así como grupos adicionales de especificación transcripcional, que pueden dar una idea de la patogénesis de la EA, proporcionando una plataforma para la generación de hipótesis. Describimos la diversidad de grupos de microglía con firmas de genes endolisosomales, uno de los cuales está enriquecido con genes de reconocimiento de ácido nucleico y regulación de interferón. Las redes de genes inferidas predicen que los grupos individuales están impulsados por distintos factores de transcripción, lo que respalda aún más la diversidad funcional de los grupos. Usando el análisis de inferencia de trayectoria, observamos transiciones en los fenotipos de microglia y relaciones predichas que pueden probarse experimentalmente. Los casos de AD se distinguieron por la aparición de un subgrupo que expresaba genes homeostáticos (subgrupo 1.5) que se caracterizaba por una transcripción alterada de genes implicados en la activación del calcio, la respuesta a las vías de lesión y motilidad.

La función endolisosomal es crítica para el tráfico y la degradación de proteínas patológicas, y la disfunción del ELN está implicada en la patogenia de la EA. Se sabe menos sobre las implicaciones de la disfunción del ELN específicamente en la microglía de AD47. Este estudio identificó tres grupos de microglía, los grupos 3, 5 y 6, que se distinguen por la expresión de los componentes de ELN, cada uno con un patrón distinto de endocitosis, tráfico de vesículas, expresión génica de la vía endolisosomal y del autofagosoma. Se propone que la alteración de la función endolisosomal microglial contribuye a la patogenia de la DA a través de una eliminación de amiloide insuficiente1,47. Sin embargo, el ELN en las células mieloides también desempeña un papel fundamental en la identificación y el procesamiento de microbios extraños, incluido el inicio de la señalización de TLR e interferón31,48. La expresión génica en el grupo 6 (el subtipo sobrerrepresentado en los casos de EA) se caracterizó por el enriquecimiento de la expresión de genes implicados en la función lisosomal y vesicular y, al mismo tiempo, por el aumento de la expresión del factor regulador del interferón y los genes de activación del inflamasoma40,42,49,50. Aunque no hay un solo fenotipo 'DAM' en la EA humana, observamos un grupo de respuesta de interferón tipo 1 distinto de un fenotipo inflamatorio distrófico o canónico18,19,37,51. Presumimos que la expresión de IRF aquí puede reflejar la exposición a moléculas de patrón molecular asociadas al peligro, incluidos los ácidos nucleicos de la microglía o las células vecinas. Esta hipótesis está respaldada por nuestra observación de microglía con inmunorreactividad al dsDNA citosólico y morfología ameboidea (Fig. 5). Estos hallazgos se alinean con estudios murinos e in vitro que demuestran que las fibrillas de amiloide contienen ácidos nucleicos e inducen una respuesta de interferón tipo I en la microglía, lo que conduce a la pérdida de sinapsis50. Song et al.49,52 informaron un papel clave para el ELN en la degradación del ácido nucleico y la respuesta del interferón al daño del ADN después de la liberación del ADN nuclear en el citosol, de acuerdo con el fenotipo que describimos aquí. La microglía del grupo 6 no solo aumentó como población en casos de EA, sino que también demostró una expresión diferencial significativa de varios genes asociados con el riesgo genético de EA (Fig. 5). Esta observación respalda la hipótesis de que la disfunción de las células inflamatorias contribuye de manera importante al riesgo de EA y sugiere que el subtipo de microglía representado por el grupo 6 puede ser un subtipo de microglía para la intervención terapéutica.

Aprovechamos nuestro conjunto de datos para aplicar métodos de trayectoria para inferir las posibles relaciones entre los fenotipos transcripcionales microgliales. Los grupos distróficos (grupo 4) y senescentes (grupo 9) emergen como "estados finales", lo que demuestra cómo la inferencia de trayectoria computacional puede mapear fenotipos microgliales consistentes con predicciones de datos empíricos previos10,16,17. Sin embargo, como con todos los análisis bioinformáticos, estos resultados deben verse como generadores de hipótesis. El análisis de trayectoria también mostró que el estrés autofágico y los grupos ELN inflamatorios (grupo 5 y grupo 6, respectivamente) representaban un punto de ramificación del grupo 1. Alternativamente, el grupo 3 parecía ser una fase de transición entre el grupo homeostático y los grupos móviles o distróficos. . Estos hallazgos son similares a un informe previo de Nguyen et al.26. Nuestro análisis nomina reguladores genéticos de cada grupo y, en conjunto, estos datos se pueden usar para guiar estudios adicionales para probar la plasticidad o la reversibilidad del fenotipo de la microglía53. Además, a diferencia de otros tipos de células que se diferencian terminalmente, es plausible que la microglía pueda entrar y salir de los estados transcriptómicos, lo que subraya la naturaleza de "instantánea" de la ómica tisular.

Detectamos un fenotipo de microglía específico de AD, subgrupo 1.5, dentro del grupo que expresa marcador homeostático, grupo 1. El apodo 'homeostático' a menudo se invoca para describir un grupo que expresa genes denominados homeostáticos debido a su expresión disminuida tras la activación microglial. Se desconoce si estos genes realmente tienen un papel activo en la dirección de una célula activada o lesionada para que reanude un estado menos reactivo o en el mantenimiento de un estado particular. Sin embargo, encontramos que el grupo identificado como 'homeostático' utilizando los marcadores homeostáticos típicos desmiente una complejidad de perfiles de microglía que pueden contener pistas sobre cambios microgliales tempranos o sutiles en respuesta a la patología de EA. Como ejemplo, el subgrupo 1.5 muestra la expresión más alta de P2RY12, así como la expresión de genes que sugieren otra capa de actividad. Cabe destacar que P2RY12 está asociado con fenotipos microgliales activos y se considera esencial para las etapas iniciales de la motilidad durante la inflamación54. El gen regulado de manera más diferencial en el subgrupo 1.5 es PDE4b, una fosfodiesterasa implicada en la función cognitiva55 y la activación inflamatoria de células mieloides56,57. PDE4b regula los niveles de cAMP, que se demostró que modula el comportamiento de vigilancia de la microglía58. El subgrupo 1.5 también demuestra un enriquecimiento de la motilidad y las vías de señalización del calcio, lo que podría sugerir una respuesta a la actividad neuronal o la extensión de los procesos microgliales53. Por lo tanto, especulamos que el subgrupo 1.5 puede representar cambios de fenotipo microglial tempranos o sutiles en respuesta a la proteína patológica, pero no un fenotipo completamente activado inmunológicamente.

Al igual que con todos los estudios de snRNA-seq, nuestro estudio tiene limitaciones. Aunque la clasificación PU.1 proporciona una forma de aumentar los núcleos de microglia para una mayor resolución de fenotipos a nivel de sujeto individual, potencialmente selecciona una población específica de microglia. Además, aunque los marcadores mieloides periféricos y microgliales conocidos utilizados para anotar las células aumentaron la confianza en una designación microglial, aún es posible que los núcleos incluidos puedan ser un tipo de célula mieloide cerebral diferente. Los DEG que se identificaron utilizando grupos definidos por los mismos datos no necesariamente se controlan adecuadamente59; sin embargo, nuestro conjunto de datos permitirá que otros usen nuestros clústeres para mitigar esto en el futuro. Aunque la cantidad total de microglía de cada sujeto es grande, la cantidad total de sujetos estudiados es de 22. Se necesitan estudios adicionales en cohortes más grandes para validar estos hallazgos o tal vez brindar información adicional sobre la diversidad microglial. La expresión génica es una herramienta molecular útil para la subtipificación celular, pero no siempre describe directamente la expresión, localización o función de las proteínas60. Los estudios futuros que analicen un panel de proteínas basado en las firmas transcriptómicas informadas aquí serán valiosos tanto para la validación como para la correlación espacial con características patológicas. La evaluación de los fenotipos microgliales en las regiones del cerebro puede proporcionar un contexto adicional para la comprensión de la heterogeneidad fenotípica. Otra limitación importante es el uso de tejido cerebral de autopsia. Es posible que los eventos justo antes de la muerte o los cambios post mórtem contribuyan a los cambios de expresión medidos aquí. Para mitigar la variabilidad de la calidad del tejido, seleccionamos solo tejidos con un pH superior a 6,0 y un intervalo post mortem (PMI) inferior a 10 h.

En este estudio, identificamos estados de microglía a partir de núcleos cerebrales post mórtem humanos aislados. Entre los núcleos que cumplen los criterios para una firma transcriptómica de microglía, se observó una "firma de envejecimiento" en todos los grupos de este estudio23, en consonancia con nuestra cohorte de mayor edad. Inflammaging61 no solo puede confundir las interpretaciones de los perfiles de expresión génica atribuibles a la EA, sino que también puede contribuir a los mecanismos de la enfermedad que, según la hipótesis, impulsan la EA. Los estudios adicionales que exploran las diferencias entre los controles más jóvenes y la EA de inicio temprano también pueden ayudar a explorar las firmas específicas del envejecimiento, la inflamación y la EA. Nuestra identificación de múltiples grupos de internalización y tráfico con diferentes patrones de expresión de genes metabólicos e inflamatorios proporciona una plataforma para estudios adicionales. Encontrar un subgrupo específico de AD dentro de la población de microglía enriquecida para la expresión de genes homeostáticos también sugiere que la AD cambia y, por lo tanto, las vías moleculares que impulsan la AD pueden identificarse en células que aún no se han explorado por completo. Las alteraciones específicas del grupo en la composición, la expresión génica y la regulación génica en el cerebro con EA brindan información adicional para respaldar la orientación personalizada de las respuestas fisiológicas microgliales que serán fundamentales para avanzar en la terapéutica de enfermedades neurodegenerativas.

Nuestra investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes y fue aprobada por la junta de revisión institucional de la Universidad de Washington. El tejido de la corteza prefrontal dorsolateral (dlPFC) de cerebros humanos se obtuvo del Núcleo de Neuropatología del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer de la Universidad de Washington después del consentimiento informado por escrito. Se confirmó post mortem que los pacientes (n = 12) tenían patología de EA (puntuación de cambio neuropático de la enfermedad de Alzheimer (ADNC) de 2–3; Tabla 1). Los individuos de control (n = 10) tenían una neuropatología baja o nula después de la muerte (puntuación de ADNC de 0 a 1; Tabla 1).

Las muestras de cerebro se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 °C. Los criterios de inclusión incluyeron PMI ≤10 h, patología comórbida baja (cuerpos de Lewy y esclerosis del hipocampo) y un pH cerebral en la autopsia ≥6.

Los núcleos de muestras de cerebro se aislaron utilizando protocolos adaptados de 10x Genomics Demonstrated Protocols y De Groot et al.62. En resumen, se recogieron cuatro punzones de 2 mm de materia gris dlPFC utilizando un punzón de biopsia (Thermo Fisher Scientific) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo seco. Todas las recetas de tampones, soluciones y medios se pueden encontrar en las tablas complementarias 1–7. El aislamiento de núcleos utilizó tampón de lisis de núcleos. Los núcleos en solución de suspensión de núcleos se colocaron en capas sobre 900 µl de tampón de gradiente de percoll/mielina62. El gradiente se centrifugó a 950 g durante 20 min a 4 °C con aceleración lenta y sin freno. Se aspiraron la mielina y el sobrenadante, y el sedimento de núcleos se resuspendió en tampón de resuspensión a una concentración de 1000 núcleos por microlitro y se procedió inmediatamente a snRNA-seq.

En resumen, se recogieron 100–250 mg de materia gris dlPFC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo seco. El tejido cerebral se homogeneizó como antes. El homogeneizado se incubó a 4 °C con agitación suave durante 10 min, se sedimentó a 500 g durante 7 min a 4 °C y se resuspendió en 900 µl de tampón de gradiente percoll/mielina suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. La suspensión se cubrió suavemente con 300 µl de solución de suspensión de núcleos complementada con inhibidores de proteasa y fosfatasa. El gradiente se centrifugó a 950 g durante 20 min a 4 °C con aceleración lenta y sin freno. Se aspiraron la mielina y el sobrenadante, y el sedimento de núcleos pasó inmediatamente a FANS.

Los núcleos se lavaron con medio FANS frío (10 % FBS, 10 mM HEPES, 100 μM ATA, 10 % 10x HBSS, 0,5 % Protector RNase Inhibitor, inhibidores de proteasa y fosfatasa y 1 % de saponina en agua libre de nucleasas) y se resuspendieron en FANS medio a una concentración de 2–2,5 × 106 núcleos por mililitro. Los núcleos se incubaron con bloque Fc humano al 1 % (clon Fc1.3216, BD Biosciences) en hielo durante 10 min. Los núcleos se marcaron con anti-PU.1-PE (clon 9G7, 1:50, tecnología de señalización celular) o control de isotipo IgG-PE (clon DA1E, 1:50, tecnología de señalización celular) durante 4 h en hielo, seguido de tres lavados con medio FANS frío y resuspendido en medio FANS suplementado con 10 μg ml−1 DAPI (Sigma-Aldrich). Los núcleos se clasificaron utilizando un FACSAria III (BD Biosciences) hasta que se recogieron 30.000 núcleos positivos para PU.1. Los núcleos clasificados se centrifugaron a 1000 g durante 10 min a 4 °C. El sedimento de núcleos se resuspendió en tampón de resuspensión a una concentración de 1000 núcleos por microlitro y se procedió inmediatamente a snRNA-seq.

Las bibliotecas de un solo núcleo se generaron utilizando Chromium Next GEM Single Cell 3 'GEM, Library and Gel Bead Kit versión 3 (10x Genomics) de acuerdo con el protocolo del fabricante y una captura objetivo de 10,000 núcleos. Las bibliotecas de expresión génica se secuenciaron en la plataforma NovaSeq 6000 (Illumina).

Los recuentos de genes se obtuvieron alineando las lecturas con el genoma hg38 (GRCh38-1.2.0) utilizando el software CellRanger 3.0.2 (10x Genomics). Se incluyeron lecturas de mapeo de ARNm precursor para tener en cuenta las transcripciones nucleares no empalmadas. La mayor parte de nuestro análisis se realizó en R (R Development Core Team 2010). Las gotas de 22 muestras clasificadas de PU.1 se combinaron utilizando la versión 3.3 de Seurat (ref. 63). Las gotas sin clasificar y clasificadas con PU.1 aisladas de los mismos cuatro sujetos se combinaron usando Seurat y se analizaron de la misma manera. Se excluyeron del análisis las gotas que contenían menos de 350 identificadores moleculares únicos, menos de 350 genes o más del 1 % de genes mitocondriales. El ARN ambiental se eliminó de las gotitas restantes usando SoupX64. Las gotas que contenían múltiples núcleos se puntuaron usando Scrublet65 y se eliminaron. En total, 200948 núcleos con un promedio de 1787 genes por núcleo permanecieron en el conjunto de datos para su posterior análisis.

La normalización y el agrupamiento de los núcleos se realizaron utilizando Seurat versión 3.3 (ref. 63). Los datos se normalizaron para la profundidad de lectura y el contenido de genes mitocondriales se regresó utilizando SCTransform66 de Seurat. La variabilidad de la muestra individual se eliminó utilizando las funciones de anclaje e integración de Seurat63. Se mantuvieron los 5000 genes variables principales. Se usaron quince componentes principales (PC) para crear un gráfico de vecinos más cercanos compartido con k = 20. La función de modularidad se optimizó usando una resolución de 0.2 para determinar grupos usando el algoritmo de Louvain con refinamiento multinivel para determinar tipos de celda amplios. Cada grupo alcanzó un umbral mínimo de 30 DEG definidores y comprendía núcleos de más del 10 % de la cohorte (más de dos individuos).

Los grupos se anotaron según el tipo de célula mediante la evaluación manual de un conjunto de marcadores genéticos conocidos67. Se hizo un nuevo objeto Seurat que contenía solo los núcleos de microglía (n = 127,371). La normalización, la eliminación de la variabilidad individual, la integración y la creación de gráficos de vecinos más cercanos compartidos se repitieron como se indicó anteriormente en los núcleos de microglía. Se eligieron veinte PC para dar cuenta de una cantidad significativa de la varianza. Los conglomerados se determinaron utilizando el algoritmo de Leiden68 con method=igraph y weights=true. Los grupos se conservaron en gran medida a través del análisis de Louvain, Louvain con refinamiento multinivel y algoritmos de Leiden. La subagrupación de grupos homeostáticos tanto para el conjunto de datos de 22 muestras como para el conjunto de datos de alelos APOE ε3/ε3 se produjo después de la normalización, la eliminación de la variabilidad individual y la integración como antes, y se realizó utilizando 10 PC y Louvain con un algoritmo de refinamiento multinivel. La distribución de núcleos dentro de cada grupo se calculó utilizando la función 'chisq.test' en R para comparar el porcentaje real de núcleos del AD o del grupo de control dentro del grupo con la proporción esperada de núcleos que se contribuirían en función de la composición del conjunto de datos. Los valores de P de las pruebas de chi-cuadrado se ajustaron utilizando la tasa de descubrimiento falso (FDR) y se consideraron significativos si se ajustaba P < 0,05.

El análisis de expresión génica diferencial de los grupos se realizó con el algoritmo MAST. Los genes analizados tenían expresión en al menos el 25 % de los núcleos del grupo. Los DEG tenían una P ajustada por FDR < 0,05 y un cambio de pliegue logarítmico > 1,25. El grupo 1 se anotó como inactivado, a menudo denominado "homeostático" en estudios de microglía de un solo núcleo. El análisis de expresión génica diferencial se repitió como se indicó anteriormente comparando cada uno de los otros grupos con el grupo 1. GSEA se realizó en ClusterProfiler69 modificado para usar una semilla establecida para la reproducibilidad, usando los conjuntos de vías GO, KEGG y Reactome, versión 7.2. Las vías enriquecidas tenían una P ajustada por FDR < 0,05. Consideramos que las vías eran representativas si los resultados significativos incluían genes y funciones biológicas similares en al menos dos de las tres bases de datos principales (GO, KEGG y Reactome).

Un enfoque complementario a GSEA es realizar un agrupamiento de ontologías de procesos biológicos para identificar un conjunto más extenso de términos asociados con la lista de genes. Para caracterizar aún más los grupos ELN (3, 5 y 6), implementamos este enfoque para obtener un examen más refinado del proceso vinculado biológicamente impulsado por cada grupo. Empleamos varios enfoques diferentes para realizar este análisis, eligiendo finalmente la aplicación de agrupamiento de redes Cytoscape ClueGO70,71, que se ha empleado ampliamente en los últimos años para este propósito72,73,74,75. Esto crea una red de procesos vinculados genéticamente que va más allá de un único término GO, lo que brinda una mayor confianza de que un proceso biológico básico se ve afectado en función de la expresión diferencial de un conjunto particular de genes. Los grupos 3, 5 y 6 se enviaron de forma independiente para su análisis utilizando un algoritmo de enriquecimiento positivo unilateral que emplea pruebas hipergeométricas, con un umbral kappa de 0,4 para optimizar las conexiones del proceso biológico. Cada término introducido en la red se filtró inicialmente para el umbral de correcciones de pruebas múltiples de P < 0,05 y se ponderó jerárquicamente para los términos con un valor de corrección de Benjamini-Hochberg de P < 0,01. Como este procedimiento se realiza para validación y visualización, recortamos redes de términos de menor rango para facilitar la visualización.

El análisis de trayectoria se realizó utilizando Monocle3 (ref. 45) en múltiples permutaciones de nuestro conjunto de datos reducido. Los datos se muestrearon a 1000, 2000, 3000 o 5000 núcleos por grupo y se transfirieron a un objeto de conjunto de datos de celda, y se ejecutó Monocle3 'learn_graph'. Se extrajeron del objeto Seurat el análisis de componentes principales y las incrustaciones de proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP). Aplicamos el algoritmo con y sin un punto de partida definido. Los 5000 núcleos por grupo de datos reducidos comenzaron a romper la capacidad de Monocle para formar una trayectoria consistente, mientras que las permutaciones múltiples de 1000, 2000 y 3000 formaron consistentemente algo similar a la imagen representativa en la Fig. 5 (3000 núcleos por grupo) .

Los regulones se infirieron usando el flujo de trabajo SCENIC en Python (pySCENIC)76,77. Seleccionamos aleatoriamente 2000, 3000 o 5000 núcleos en cada grupo (o, si tienen menos de este número, todos los núcleos del grupo) para reducir el tiempo computacional y tener una representación proporcional de todos los grupos. Hicimos cinco subconjuntos de cada combinación y repetimos el análisis dos veces para cada subconjunto para evaluar la consistencia de los regulones en el análisis. En primer lugar, utilizamos recuentos normalizados con genes muy variables para generar los módulos de red reguladores de coexpresión utilizando el algoritmo de aprendizaje automático GRNBoost2 con la función 'grn' y la configuración predeterminada76. En segundo lugar, los módulos se filtraron utilizando la función '-ctx', que utiliza el análisis de motivos reguladores en cis (RcisTarget) para mantener solo los módulos enriquecidos para los genes diana putativos del factor de transcripción. Los regulones se identifican combinando múltiples módulos para un solo factor de transcripción. En tercer lugar, se utilizó la función AUCell para calcular la actividad del regulón para cada núcleo. Las puntuaciones de especificidad de Regulon se calcularon para cada regulon en cada grupo. Los puntajes de especificidad de la clasificación identificaron los 10 regulones principales para un grupo específico para un subconjunto dado del conjunto de datos y la consistencia de los hallazgos entre los subconjuntos.

Los tejidos disecados del dlPFC de los 22 casos de la cohorte se fijaron con paraformaldehído y se incluyeron en parafina. Las muestras se seccionaron a 15 µm y se desparafinaron antes de la inmunotinción. Los portaobjetos se hirvieron en tampón de citrato (Sigma-Aldrich, C9999) durante 20 min y luego se transfirieron a tampón de bloqueo (suero de burro al 10 %, Trition X-100 al 0,1 % y Tween 20 al 0,05 % en TBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron en anticuerpos primarios (anti-LAMP1 1:100, Invitrogen, 14-1079-80; anti-Iba-1 1:250, Abcam, ab5076; anti-dsDNA 1:250, Millipore, MAB1293; anti-PTGDS/ PGD2 1:100, R&D Systems, MAB10099; anti-P2RX7 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-514962; anti-P2RY12 1:50, Alomone, APR-012; y anti-PDE4B 1:50, LSBio, LS- C173292-100) durante la noche a 4 °C. Los portaobjetos se enjuagaron tres veces en TBS-T durante 5 minutos antes del anticuerpo secundario (Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor 488 burro anti-cabra, A11055; Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor 555 burro anti-ratón, A31570; Alexa Fluor 555 burro anti- conejo 555, A31572; burro anti-ratón Alexa Fluor 647, A31571; o burro anti-conejo Alexa Fluor 647, A32795) incubación durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con DAPI (1:1000, Millipore, D8417) durante 5 min, seguido de tres lavados TBS-T de 5 min. Se añadió True Black (Thermo Fisher Scientific, NC1125051) diluido 1:20 en etanol al 70 % a los portaobjetos durante 50 s, seguido de dos lavados adicionales de 5 min en TBS antes de montarlos con Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100-01 ). Se tomaron imágenes de los portaobjetos utilizando un microscopio confocal Olympus FluoView-1000 o un microscopio confocal de disco giratorio (Nikon A1R con cabezal de disco giratorio Yokogawa W1) con objetivos de aceite de ×40 y ×100, y se generó la proyección máxima de imágenes de pila z. Las imágenes se eliminaron con Fiji.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los informados en publicaciones anteriores22,25,26. La recopilación de datos y los análisis no se realizaron sin conocer las condiciones de los experimentos. No se excluyeron datos de los análisis. El principal conjunto de datos de snRNA-seq del enriquecimiento de PU.1 de dlPFC proviene de 22 humanos (12 AD y 10 donantes de edad sana), todos mayores de 60 años. Debido a que las muestras se obtuvieron de seres humanos y el estudio se diseñó para detectar diferencias entre los casos de EA y los cerebros sanos envejecidos, las muestras no se aleatorizaron entre las condiciones. Contrapesamos los lotes de secuenciación por sexo y estado de la enfermedad de modo que todas las condiciones estuvieran presentes en cada lote de secuenciación. El análisis estadístico para datos pseudobulk RNA-seq y snRNA-seq utilizó DESeq2 y MAST, respectivamente. DESeq2 está diseñado para modelar los datos de recuento de RNA-seq mediante una distribución binomial negativa, y MAST está diseñado para modelar la inflación cero observada en los datos de snRNA-seq. Para el análisis estadístico de la proporción de conglomerados, se utilizaron datos de recuentos, que no se basan en una distribución normal. Cuando se redujo la muestra del conjunto de datos para el análisis de trayectoria y la detección de regulón, se redujo la muestra aleatoriamente de los núcleos para generar múltiples iteraciones del conjunto de datos que representaron uniformemente los grupos y mantuvieron las muestras en sus proporciones originales. Para el análisis de trayectoria, se analizaron tres permutaciones de muestreo reducido a tres resoluciones de muestreo reducido (1000, 2000 o 3000 núcleos por grupo) para un total de nueve iteraciones, lo que resultó en hallazgos similares a los que se muestran en la Fig. 4. Para la detección de regulón pySCENIC, el conjunto de datos fue muestreado con cinco permutaciones a 1000 núcleos por grupo y tres permutaciones a 2000 y 3000 núcleos por grupo. Cada una de estas permutaciones se ejecutó a través de la canalización pySCENIC varias veces, lo que resultó en 27 instancias de detección de regulon. Estos 27 casos se compilaron en las puntuaciones de consistencia que se muestran en la Fig. 3 y los datos extendidos en la Fig. 6. Los experimentos que involucran inmunohistoquímica de tejido humano se replicaron, como mínimo, en muestras de cinco humanos, y las imágenes mostradas son representativas de la tinción observada en múltiples campos. de al menos tres muestras humanas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

El conjunto de datos anónimos completo generado para este recurso en sus formas sin procesar y procesadas por objetos Seurat está disponible a través de Synapse (https://www.synapse.org/#!Synapse:syn51272688). Los datos están disponibles bajo condiciones de uso controlado establecidas por las normas de privacidad humana. Para acceder a los datos, se necesita un acuerdo de uso de datos. Este registro se realiza únicamente para garantizar el anonimato de los participantes del estudio. Todos los demás datos del estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Este recurso también usó el genoma hg38 humano disponible públicamente (GRCh38-1.2.0).

Los scripts utilizados para generar nuestros análisis están disponibles en https://github.com/keprater/jayadevlab_pu.1_project. El contenedor necesario para ejecutar los scripts con el mismo Seurat y otras versiones del paquete que se usan en el código está disponible para descargar en https://hub.docker.com/r/keprater/jayadevlab/tags o en el proyecto Synapse con el conjunto de datos Utilice la etiqueta de contenedor 6.3 para replicar nuestros análisis con las mismas versiones del paquete.

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El financiamiento para estos estudios fue proporcionado por RF1AG063540 (SJ y GAG), P30AG066509 (SJ, KEP, JEY y CDK), R01AG073918 (SJ y JEY) y Weill Neurohub (SJ y CDK). La Fundación Ellison (SJ) proporcionó apoyo adicional. KEP fue apoyado por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento 5T32-AG052354-02. Los materiales de autopsia utilizados en este estudio se obtuvieron del Núcleo de Neuropatología de la Universidad de Washington, que cuenta con el apoyo del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer (P50AG005136-33) y el Estudio de Cambios en el Pensamiento en Adultos (U01AG006781). Este trabajo fue facilitado por el uso de la infraestructura computacional, de almacenamiento y de red avanzada provista por el sistema de supercomputadora Hyak en la Universidad de Washington.

Estos autores contribuyeron igualmente: Katherine E. Prater, Kevin J. Green.

Departamento de Neurología, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Katherine E. Prater, Kevin J. Green, Sainath Mamde, Alexandra Cochoit, Carole L. Smith y Suman Jayadev

Programa de Bioestadística, División de Ciencias de la Salud Pública, Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson, Seattle, WA, EE. UU.

Wei sol

Centro de Evolución y Medicina, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

Kenneth L. Chiou y Noah Snyder-Mackler

Facultad de Ciencias de la Vida, Centro de Evolución y Medicina, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

Kenneth L. Chiou y Noah Snyder-Mackler

Sage Bionetworks, Seattle, WA, EE. UU.

Laura heath, jesse wiley y benjamin logsdon

Departamento de Medicina y Patología de Laboratorio, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Shannon E. Rose, C. Dirk Keene y Jessica E. Young

Instituto de Células Madre y Medicina Regenerativa, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Ronald Y. Kwon, Jessica E. Young y Suman Jayadev

Departamento de Ortopedia y Medicina Deportiva, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Ronald Y. Kwon

ASU-Banner Centro de Investigación de Enfermedades Neurodegenerativas, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

Noah Snyder-Mackler

División de Genética Médica, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Elizabeth E. Blue y Suman Jayadev

Instituto Brotman Baty de Medicina de Precisión, Seattle, WA, EE. UU.

elizabeth e. azul

Cajal Neuroscience, Seattle, WA, EE. UU.

Benjamín Logsdon

Departamento de Bioestadística, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Ali Shojaie

Departamento de Neurología, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC, EE. UU.

Gwenn A. Jardín

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Experimentos concebidos y diseñados: SJ, KJG, KEP, JEY, CLS, BL y GAG Experimentos realizados: KJG, CLS, AC, SR y CDK Datos analizados: KEP, KJG, SM, AC, KLC y JW Supervisión de bioestadística: WS y AS Escribió el artículo: KEP, KJG, SJ, SM y AC Editó el artículo: CLS, WS, AS, JY, EEB y GAG Proporcionó el código: WS, SM, KLC, NS-M., RYK y LH Conceptualizó la investigación y colaboraciones: SJ, GAG, JEY, EEB y BL

Correspondencia a Suman Jayadev.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Aging agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(A) Gráfico de clasificación de núcleos activados por fluorescencia de núcleos aislados de la materia gris de la corteza prefrontal dorsolateral del tejido cerebral humano post mórtem que demuestra una población positiva para DAPI de la que se extraen poblaciones posteriores. (B) Ejemplos de tinción de isotipo y PU.1 que demuestran la población positiva de PU.1. (C) Los datos de snRNAseq no clasificados de cuatro muestras demuestran múltiples tipos de células cerebrales y una pequeña población de microglia (n = 1032 células) que se pueden subdividir en cinco grupos. (D) Después del enriquecimiento de PU.1, un conjunto de datos de snRNAseq de los mismos cuatro individuos contiene una mayor cantidad de microglía (n = 23 310 células), y esta microglía se puede discriminar aún más en nueve grupos.

Los genes marcadores de microglía, CX3CR1, C1Qb, SPI1 (PU.1) y APOE demuestran una mayor expresión en los 10 subgrupos de microglía (numerados del 1 al 10 a la izquierda) que en otros grupos de tipos de células (etiquetados por tipo de célula a la derecha) .

(A) Los genes marcadores de astrocitos GFAP y S100B demuestran una mayor expresión en los dos subgrupos de Astrocytes-1 y Astrocytes-2 que en los 10 subgrupos de microglía definidos. Si bien el grupo 6 de microglia tiene expresión de GFAP, no tiene expresión de S100B. (B) Los marcadores de monocitos periféricos CCL5 tienen una expresión baja en nuestro conjunto de datos, pero se expresan más en el grupo CD163+ que no se incluyó en nuestro conjunto de datos de microglía.

Los genes expresados diferencialmente en los grupos 3, 5 y 6 se emplearon para impulsar un enriquecimiento de ontología de genes basado en redes utilizando la aplicación Cytoscape ClueGO. Este enfoque utiliza un algoritmo de enriquecimiento positivo unilateral que emplea pruebas hipergeométricas, con un umbral kappa de 0,4 para optimizar las conexiones del proceso biológico. Cada término introducido en la red se filtró inicialmente para un umbral de corrección de prueba múltiple de p < 0,05 y se ponderó jerárquicamente para los términos con un valor de corrección de Benjamini-Hochberg de p < 0,01. Los nodos se representan dentro de cada red en función de dos factores: número de genes (tamaño del círculo) y significación estadística (rojo brillante = Benjamini-Hochberg corregido p < 0,05; marrón oscuro = Benjamini-Hochberg corregido p < 0,0005). (A) En el Grupo 3, se identificaron tres pequeños subgrupos asociados con endocitosis, endocitosis mediada por receptores y unión y síntesis de lípidos (extremo izquierdo); un segundo subgrupo se centra en la endocitosis sináptica (grupo medio); y un tercero involucra el transporte de vesículas (extremo derecho). (B) En el Grupo 5, se identificó un subgrupo de términos que abarcaba la autofagia, la autofagia mediada por receptores y la regulación de estos dos términos (extremo izquierdo); un segundo grupo más grande identifica la endocitosis y la endocitosis mediada por receptores, procesos relacionados con la regulación autofágica, así como el transporte vesicular. (C) En el Grupo 6, se identificaron tres subredes dentro del espacio ELN, lo que demuestra endocitosis activa, procesos lisosomales y transferencia entre estos compartimentos y la red trans-golgi (izquierda). Se identificó un segundo gran grupo de términos asociados con la función, activación y regulación inmunitaria innata, así como con procesos inflamatorios vinculados (lado derecho).

(A) UMAP de agrupación imparcial en 13 muestras de solo individuos APOE ε3/ε3 muestra 9 agrupaciones. (B) Al igual que los grupos identificados en el conjunto de datos de genotipo APOE mixto, los grupos identificados en el conjunto de datos de genotipo APOE ε3/ε3 son distintos por la expresión génica. Los 5 genes principales se muestran para cada grupo. (C) Diagramas de Venn que demuestran la superposición entre grupos de las cohortes Mixed APOE y APOE ε3/ε3 que demuestran una superposición significativa en los perfiles de expresión génica.

Estos son los factores de transcripción que con mayor frecuencia impulsaron la expresión génica en los grupos 4, 7, 9 y 10. Los valores indican el porcentaje de réplicas de permutaciones del conjunto de datos donde ese factor de transcripción era único para el grupo dado, con un color más oscuro que indica porcentajes más altos . Tenga en cuenta que, si bien se observan algunos factores de transcripción similares en varios grupos, en particular, los factores de transcripción más frecuentes son únicos y representan la expresión génica que impulsa las funciones biológicas en estos grupos.

De manera similar al conjunto de datos más grande, los factores de transcripción que impulsan la expresión génica dentro de los grupos son distintos cuando los datos se componen solo de portadores de alelos APOE ε3/ε3.

Los mapas de calor de: (A) el conjunto de Gene Ontology (GO) de genes endolisosomales demuestran una regulación positiva significativa en el Grupo 6. (B) El conjunto de genes Toll-Like Receptor (TLR) de la Enciclopedia de Kioto de genes y genomas (KEGG) demuestra una regulación positiva significativa en Grupo 8 como cabría esperar dado el fenotipo inflamatorio clásico observado en la expresión génica. (C) La lista de genes de 'Microglía asociada a enfermedad' (DAM) de Keren-Shaul et al. 2017 muestra una regulación positiva de genes en múltiples grupos en nuestro conjunto de datos humanos. Esto replica otros estudios en humanos que no han identificado un solo grupo DAM a diferencia de los estudios que involucran modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

(A) Un ejemplo representativo de tinción observada en múltiples campos en al menos tres humanos muestra una microglía activada con un gran número de lisosomas (Lamp-1, blanco) y dsDNA citosólico (magenta) en un caso de AD (punta de flecha rellena). (B) Microglia (punta de flecha puntiaguda) sin inmunorreactividad citosólica de dsDNA (magenta) en el mismo caso y la sección de tejido aparece ramificada con menos señal de Lamp-1. Todas las barras de escala representan 15 micrones.

(A) Los resultados del conjunto de datos completo se replicaron en la cohorte de alelos APOE ε3/ε3 puros, lo que sugiere que existen múltiples subpoblaciones dentro del grupo 'homeostático'. Estas subpoblaciones son distintas por la expresión génica a pesar de estar compuestas por una subpoblación 'homeostática'. (B) Dentro del Grupo 1 'homeostático' de la cohorte APOE ε3/ε3, hay un Grupo 1.5 que está significativamente aumentado en el cerebro con EA como encontramos en la cohorte completa (Fig. 6; Chi-cuadrado FDR corregido p = 6.7673 × 10 −6). **= p < 0,01.

Tablas complementarias 1–7.

Datos complementarios para el conjunto de datos de genotipo APOE mixto de 22 muestras, incluidos DEG en comparación con todos los demás grupos y en comparación con el grupo HM, vías para cada grupo identificado por GSEA y resultados pseudobulk que comparan AD con casos de control dentro de cada grupo.

Datos complementarios para el conjunto de datos APOE ε3/ε3 de 13 muestras, incluidos los DEG en comparación con todos los demás grupos y en comparación con el grupo HM, vías para cada grupo identificado por GSEA, porcentaje de superposición de DEG con los grupos de datos de genotipo APOE mixto de 22 muestras y resultados pseudobulk que comparan AD con casos de control dentro de cada grupo.

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Reimpresiones y permisos

Prater, KE, Green, KJ, Mamde, S. et al. La microglía humana muestra cambios transcripcionales únicos en la enfermedad de Alzheimer. Envejecimiento natural (2023). https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

Descargar cita

Recibido: 07 julio 2022

Aceptado: 25 de abril de 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

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