Variación del metaboloma humano a lo largo del tracto intestinal superior

Nature Metabolism volumen 5, páginas 777–788 (2023) Citar este artículo

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La mayor parte del procesamiento de la dieta humana ocurre en el intestino delgado. Los metabolitos en el intestino delgado se originan a partir de las secreciones del huésped, más el exposoma1 ingerido y las transformaciones microbianas. Aquí investigamos la variación espaciotemporal del contenido luminal del intestino superior durante la digestión diaria de rutina en 15 participantes masculinos y femeninos sanos. Para ello, utilizamos un dispositivo de muestreo no invasivo e ingerible para recolectar y analizar 274 muestras intestinales y 60 homogeneizados de heces correspondientes mediante la combinación de cinco ensayos de espectrometría de masas2,3 y secuenciación de ARNr 16S. Identificamos 1.909 metabolitos, incluidos sulfolípidos y ésteres de ácidos grasos de lípidos de ácidos grasos hidroxi (FAHFA). Observamos que los metabolomas de heces e intestinales difieren dramáticamente. Los metabolitos de los alimentos muestran tendencias en los biomarcadores dietéticos, aumentos inesperados en los ácidos dicarboxílicos a lo largo del tracto intestinal y una asociación positiva entre los cetoácidos luminales y la ingesta de frutas. Los metabolitos derivados de la dieta y vinculados a microbios representan las mayores diferencias entre individuos. En particular, dos personas que habían tomado antibióticos dentro de los 6 meses anteriores al muestreo mostraron una gran variación en los niveles de FAHFA bioactivos y sulfolípidos y otros metabolitos microbianos relacionados. A partir de la variación interindividual, identificamos a las especies de Blautia como candidatas para participar en el metabolismo de FAHFA. En conclusión, el muestreo in vivo no invasivo del intestino delgado humano y el colon ascendente en condiciones fisiológicas revela vínculos entre la dieta, el huésped y el metabolismo microbiano.

Nuestro objetivo fue estudiar exhaustivamente las diferencias metabolómicas entre muestras luminales del tracto intestinal superior de 15 individuos sanos para comprender mejor el alcance de la variación espacial y temporal y medir las perspectivas de integrar datos de metaboloma y microbioma. En una publicación complementaria relacionada4, usamos estos dispositivos para estudiar la variación a lo largo del intestino en la composición de la microbiota, la inducción de profagos, el proteoma del huésped y la modificación microbiana de los ácidos biliares. Los voluntarios ingirieron conjuntos de cuatro dispositivos de muestreo por punto de tiempo de muestreo. Estos dispositivos de muestreo ingeribles consistían en una vejiga de recolección colapsada tapada por una válvula unidireccional en una cápsula con un revestimiento sensible al pH. Los cuatro tipos de dispositivos diferían únicamente en su recubrimiento entérico, que se disolvía a pH 5,5 (tipo 1), pH 6 (tipo 2) y pH 7,5 (tipos 3 y 4) (Fig. 1a). El grosor y la capacidad de respuesta al pH del recubrimiento permitieron tomar muestras en lugares específicos del tracto intestinal después del vaciado gástrico. Los dispositivos no contenían ningún componente electrónico más allá de un chip pasivo de identificación por radiofrecuencia con fines de seguimiento. Una vez que los recubrimientos se disolvieron, una vejiga de recolección elástica se expandió y recolectó hasta 400 µl de contenido luminal mediante succión al vacío. La válvula unidireccional evitó la pérdida de muestra y la contaminación de los fluidos aguas abajo. Las muestras de heces se congelaron a -20 °C y todos los dispositivos se recuperaron de las heces antes del análisis. Los contenidos líquidos se recuperaron de los dispositivos utilizando agujas hipodérmicas. Se usaron alícuotas de la muestra sin procesar para análisis de microbioma de ARN ribosómico 16S y los sobrenadantes de muestras centrifugadas se usaron para estudios metabolómicos. Aquí, realizamos un análisis meticuloso del metaboloma en las mismas muestras, informando metabolitos nunca antes detectados en muestras humanas, biomarcadores clave de la dieta y comparación de perfiles químicos entre y dentro de los participantes (Tablas complementarias 1 y 2).

a, Diseño del estudio para la investigación del tracto intestinal superior. Se usaron cuatro tipos de dispositivos de muestreo intestinal para tomar muestras de los intestinos superiores proximales a distales. Quince participantes humanos tragaron al menos 16 dispositivos durante 2 días después del almuerzo y después de la cena después de una prueba inicial el día 1. Los dispositivos se recuperaron y analizaron mediante métodos LC-MS/MS y GC-MS dirigidos y no dirigidos. b, metabolitos identificados de los cinco ensayos de metaboloma utilizados para analizar muestras. Las fracciones de clase química se incluyen en función de la clasificación química automatizada de ClassyFire. c, la importancia de las diferencias entre las regiones del tracto intestinal superior se calculó utilizando LMM. La línea horizontal discontinua-punteada representa el umbral de significación P < 0,05 (n = 1182 metabolitos). Los círculos indican ausencia de significación y las formas de diamante indican importancia (P < 0,05) después de la corrección FDR. Solo se incluyeron en este análisis los metabolitos detectados en >50 % de las muestras intestinales (n = 1182). El coeficiente de tamaño del efecto es la pendiente estimada por LMM, con un coeficiente positivo (negativo) que indica niveles más altos (más bajos) en el intestino superior distal en comparación con el proximal. Las líneas verticales discontinuas tienen un coeficiente de tamaño del efecto de ±0,2.

El pH medido del contenido luminal para los tipos de dispositivos 1 a 4 fue consistente con el gradiente de pH esperado a lo largo del tracto intestinal4,5, que cubre el duodeno, el yeyuno, el íleon y el colon ascendente (Fig. 1a). El pH en los dispositivos de tipo 1 y 2 fue significativamente diferente al de los dispositivos de tipo 3 y 4 (datos ampliados, figura 1a y tabla complementaria 3; prueba de suma de rango bidireccional de Wilcoxon, P = 2,4 × 10−14), mientras que el pH no significativamente diferente entre los dispositivos de tipo 1 y tipo 2 o entre los dispositivos de tipo 3 y tipo 4 (Datos ampliados Fig. 1a). Por lo tanto, asociamos los dispositivos de tipo 1/2 y 3/4 con regiones proximales (duodeno y yeyuno) y distales (íleon y colon ascendente) del tracto intestinal superior, respectivamente.

Utilizamos cinco ensayos de espectrometría de masas para analizar los contenidos luminales capturados por estos dispositivos de cápsula y las muestras de heces asociadas. Al hacer coincidir los tiempos de retención cromatográfica, las masas precisas de los precursores y la fragmentación espectrométrica de masas (MS/MS) con las bibliotecas públicas de MassBank.us y con licencia del NIST20, anotamos 1909 sustancias químicas del contenido luminal intestinal y de las heces en los niveles de confianza de Metabolomics Standards Initiative 1–3 (Tabla complementaria 1)6, incluidos 155 estándares internos utilizados para el control de calidad (QC) y fines de cuantificación. Además, se detectaron de forma fiable más de 12 000 características cromatográficas desconocidas por encima del nivel de los blancos del método (Tabla complementaria 2). Usando el software ClassyFire7, los metabolitos anotados estructuralmente se clasificaron en 61 subclases químicas (Tabla complementaria 1). Dos ensayos MS/MS de cromatografía líquida (LC) de alta resolución no dirigidos centrados en metabolitos hidrofílicos y lipofílicos produjeron la mayoría de los compuestos anotados, con 1612 identificaciones. La cromatografía de gases (GC)-MS no dirigida agregó 119 metabolitos primarios, complementados con seis ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y un ensayo LC-MS/MS dirigido para 17 ácidos biliares (Fig. 1b). El análisis de control de calidad de la varianza metabólica total reveló la separación de las muestras intestinales y de heces, con una fuerte agrupación de muestras de control de calidad agrupadas (Datos ampliados, Fig. 1b).

Los resultados del metaboloma revelaron diferencias notables entre las muestras intestinales y de heces (datos ampliados, figura 2) y entre las muestras del tracto intestinal (datos ampliados, figura 3). Para descubrir las diferencias espaciales a lo largo del intestino, aplicamos modelos lineales de efectos mixtos (LMM) que representaban la ubicación del muestreo (proximal o distal), así como otras variables (Tablas complementarias 3 y 4). Específicamente, estudiamos los 1182 metabolitos más frecuentes que se detectaron en >50 % de las muestras de dispositivos. De estos, 630 (54%) fueron significativamente diferentes en el intestino superior proximal en comparación con el distal (tasa de descubrimiento falso (FDR) P <0.05; LMM) (Fig. 1c y Tabla complementaria 4), con 473 metabolitos en niveles más altos en el proximal en comparación con el intestino superior distal y 157 compuestos a niveles más bajos en el intestino proximal en comparación con el intestino superior distal (Fig. 1c). Los productos químicos generados por microbios conocidos, incluidos los SCFA8,9, los ácidos biliares secundarios10 y algunos ácidos biliares conjugados por microbios11,12, aumentaron desde el intestino superior proximal al distal (Tabla de datos ampliados 1 y Fig. 1c). De los 11 aminoácidos acetilados detectados, 7 aumentaron desde el intestino superior proximal al distal (P sin procesar < 0,05; LMM) (Tabla de datos ampliados 1 y Fig. 1c). También examinamos las 12,346 señales de metabolitos químicamente no anotadas, restringiendo nuestra atención a 9,317 señales que se detectaron en> 50% de las muestras intestinales (Archivo complementario 1). En general, 3594 (38 %) características fueron significativamente diferentes entre el intestino superior proximal y distal, con 1937 características en niveles más altos en el intestino superior proximal en comparación con el distal y 1657 características en niveles más bajos en el intestino superior proximal en comparación con el distal (FDR P < 0,05; LMM) (Datos ampliados Fig. 4).

Para interrogar las diferencias metabólicas generales entre ubicaciones, utilizamos estadísticas de enriquecimiento químico. Los dipéptidos y tripéptidos se encontraban entre las clases más significativamente reducidas desde el intestino superior proximal al distal (Tabla 1 de datos ampliados y Fig. 5 de datos ampliados). De los 333 dipéptidos y tripéptidos medidos, 262 disminuyeron significativamente en abundancia desde el intestino superior proximal al distal (P sin procesar < 0,05; LMM) (Tabla 1 de datos ampliados). Los azúcares, los alcoholes de azúcar, los nucleósidos, las carnitinas y las ceramidas también exhibieron niveles significativamente más altos en las muestras del tracto intestinal proximal en comparación con las muestras distales (Tabla 1 de datos ampliados y Fig. 5 de datos ampliados). Estas diferencias espaciales en el intestino reflejan la digestión y absorción clásicas13 de dipéptidos y tripéptidos14 y acilcarnitinas15,16, así como ceramidas que se hidrolizan a esfingosina y ácidos grasos libres antes de la absorción intestinal17. Por el contrario, los SCFA exhibieron mayores niveles en las regiones distales (Tabla de datos ampliados 1 y Fig. 1c), probablemente debido a su producción por microbios8,9. Los aminoácidos acetilados, que se han asociado con la enfermedad de Crohn18, también se encontraban en niveles más altos en el intestino distal en comparación con el superior proximal (Tabla 1 de datos ampliados y Fig. 1c), posiblemente debido a una absorción más lenta de los aminoácidos acetilados en comparación con los no acetilados19 ,20. Los ácidos biliares son ampliamente transformados por microbios y los niveles de ácidos biliares secundarios aumentan a lo largo del intestino4. Estas observaciones respaldan la idea de que los dispositivos de cápsula tomaron muestras de las ubicaciones previstas. Aunque los niveles promedio de pH en los dispositivos de un tipo dado también siguieron las tendencias esperadas en el tracto intestinal superior, la variación observada en el pH dentro de la persona para cada tipo de dispositivo no se correlacionó con los cambios metabolómicos en las regiones distales versus proximales.

Medimos 28 metabolitos fenólicos que aumentaron desde el intestino superior proximal al distal (Tabla complementaria 4). Es probable que estas tendencias se deban a una combinación de factores, incluida la transformación enzimática21,22, como la desglicosilación y la descomposición retardada de las células vegetales y los componentes de la pared celular por enzimas microbianas23,24,25. Por ejemplo, el lignano secoisolariciresinol asociado a la linaza se enriqueció más significativamente en las muestras distales en comparación con las proximales, probablemente debido tanto a la biodisponibilidad26 como a la desglicosilación27.

Los ácidos dicarboxílicos también aumentaron en concentración desde el intestino superior proximal al distal (Tabla de datos ampliados 1 y Fig. 1c). De hecho, tres de los seis principales metabolitos que aumentaron significativamente entre el intestino superior proximal y distal fueron los ácidos dicarboxílicos (ácido hexadecanodioico, ácido tetradecanodioico y ácido octadecanodioico) (Fig. 1c). Los ácidos dicarboxílicos se generan durante el catabolismo (oxidación omega) de los ácidos grasos, que se produce en las células humanas28, las plantas29 y los microbios30,31. El compuesto principal, el ácido hexadecanodioico, se correlacionó más fuertemente con otros ácidos dicarboxílicos, metabolitos de plantas, ácidos biliares y compuestos conocidos producidos por microbios (Tabla complementaria 5). Las células epiteliales contienen lípidos omega-hidroxilados esenciales para mantener la función de barrera del epitelio32 que las lipasas pueden escindir para formar ácidos dicarboxílicos. Presumimos que el aumento constante y significativo de ácidos dicarboxílicos a lo largo del intestino superior se debe al catabolismo de los lípidos epiteliales humanos.

Los perfiles químicos de las muestras intestinales diferían sustancialmente de los de las heces (Datos ampliados Fig. 2). Treinta y un metabolitos fueron >100 veces más abundantes en promedio en el intestino en comparación con las heces. Estos metabolitos consistían en lípidos glicinados, azúcares, productos naturales de plantas, carnitinas, ácidos biliares conjugados microbianamente y S-succinilcisteína (Tabla complementaria 6). Los péptidos también se encontraban generalmente en niveles mucho más bajos en las muestras de heces en comparación con las muestras intestinales, especialmente en comparación con el intestino proximal (Datos ampliados, Fig. 2). También identificamos >100 metabolitos que eran >100 veces más abundantes en las heces en comparación con las muestras intestinales (Tabla complementaria 6); estos metabolitos eran en su mayoría lípidos polares como fosfatidiletanolaminas, fosfatidilinositoles y fosfatidilgliceroles, así como FAHFA específicos. La gran abundancia de lípidos de membrana en las muestras de heces probablemente se deba a la gran cantidad de material celular bacteriano en las heces en comparación con las muestras luminales del intestino superior.

Luego, usamos LMM para probar las asociaciones de los registros de ingesta de alimentos registrados por los participantes con los niveles de metabolitos del tracto intestinal. Probamos el consumo de frutas, alcohol, postres, proteínas animales, vegetales, granos, café/té y alimentos lácteos ingeridos 6 h antes de tragar los dispositivos de cápsula (Tabla complementaria 3). Después de corregir las pruebas de hipótesis múltiples, algunos tipos de alimentos no tenían metabolitos significativamente asociados, como era de esperar debido al pequeño tamaño de la muestra para algunos tipos de alimentos y la fuerte corrección FDR que representa las pruebas de 1182 metabolitos (Tabla 1, Fig. 2a-d y Tabla complementaria 4). A pesar del pequeño tamaño de este estudio con 15 participantes, pudimos validar una variedad de biomarcadores dietéticos que se encontraron previamente en la sangre y se correlacionaron con el consumo de frutas33 y alcohol34, así como descubrir otros biomarcadores no identificados previamente.

a,b,d, los gráficos de volcanes muestran la importancia de cada metabolito para los tipos de alimentos de fruta (a), alcohol (b) y postre (d) calculados por LMM. El consumo se define como los alimentos ingeridos dentro de las 6 h posteriores a la ingestión de los dispositivos de muestra. La importancia de P < 0,05 (n = 1.182 metabolitos) está delimitada por la línea horizontal de puntos discontinuos inferior. Los círculos indican no significancia después de la corrección FDR y los diamantes indican significación (P < 0,05) después de la corrección FDR (n = 1182). Los metabolitos detectados en >50% de las muestras intestinales se incluyeron en este análisis. El coeficiente de tamaño del efecto es la estimación de la pendiente calculada por LMM, con un coeficiente positivo (negativo) que significa que el metabolito fue más alto (más bajo) después del consumo de alimentos. Las líneas verticales discontinuas tienen un coeficiente de tamaño del efecto de ±0,2. c, el análisis de estadísticas de enriquecimiento químico (ChemRICH) reveló clases químicas significativas después del consumo de fruta visualizadas mediante la separación de clases por lipofilicidad química (logP) y nivel de significancia de clase química de −log10(P). Los círculos rojos indican que la clase química aumentó después del consumo de fruta y el círculo azul indica que la clase química disminuyó después del consumo de fruta. El tamaño del círculo indica el tamaño de la clase química. e, Los niveles de teofilina y teobromina están fuertemente asociados con los niveles de cafeína. Los círculos representan los niveles medidos en cada muestra para la que se detectaron ambos metabolitos. f, Diagrama químico de la cafeína y rutas metabólicas conocidas con estructuras de metabolitos detectados y coeficiente de correlación de rango de Spearman (rs) para cada estructura (P < 1,0 × 10−13 para todos los metabolitos; n = 1182 metabolitos).

Usando diferencias en el tamaño del efecto de ±0,2 y P sin procesar <0,05, el consumo de fruta se asoció significativamente con 20 compuestos en concentración aumentada y 17 metabolitos en concentración disminuida (Fig. 2a). Algunos metabolitos se relacionaron directamente con el consumo de frutas, incluso con una P < 0,05 estricta corregida por FDR (Fig. 2a), incluidas la N-metilprolina y la estaquidrina, las cuales se informaron previamente como biomarcadores del consumo de frutas para el plasma sanguíneo en estudios dietéticos no controlados33. La betonicina, un componente conocido del jugo de frutas35, también aumentó después del consumo de frutas a P < 0,05 sin procesar (Fig. 2a), pero no alcanzó el umbral de significancia de FDR. De manera similar, tres cetoácidos (ácido 4-metil-2-oxovalérico, ácido cetoisovalérico y ácido 3-metil-2-oxovalérico) también aumentaron significativamente en respuesta a la ingesta de fruta con P < 0,05 sin procesar (Fig. 2a). Los metabolitos no son independientes unos de otros, sino que están vinculados a través de las composiciones de los alimentos y las vías microbianas y enzimáticas. Por lo tanto, utilizamos las estadísticas de enriquecimiento del conjunto químico de ChemRICH para identificar grupos de metabolitos significativamente alterados (Fig. 2c). Esta estrategia reveló que los cetoácidos son la clase química con la respuesta más significativa a la fruta (Fig. 2a,c), destacando a los cetoácidos como un biomarcador de frutas en el intestino humano. Los cetoácidos se forman a partir de la desaminación enzimática de aminoácidos, realizada en parte por las bacterias intestinales36. En particular, ChemRICH también reveló que los ingredientes típicos de las frutas, como los fenilacetatos y los productos naturales fenólicos, se asociaron positivamente con la ingesta de frutas (Fig. 2c).

El consumo de alcohol se asoció más significativamente con el sulfato de etilo (FDR P < 0,05), un conocido biomarcador plasmático del consumo de alcohol (Fig. 2b)34. La estaquidrina se relacionó con el consumo de frutas y alcohol (FDR P < 0,05). Trp-Lys disminuyó significativamente con el consumo de alcohol después de la corrección de FDR (Fig. 2b). En total, 40 dipéptidos y tripéptidos disminuyeron con el consumo de alcohol (P sin procesar <0,05) con un grupo ChemRICH P = 8,8 × 10−18 (Tabla complementaria 4 y Figuras complementarias 1 y 2). La disminución de los dipéptidos y tripéptidos después del consumo de alcohol sugirió una disminución en la actividad de la proteasa total, posiblemente debido a la alteración de la secreción pancreática37,38 más que a la inhibición directa porque la tripsina y la quimotripsina son activas incluso en una solución de etanol al 20%39. 'Postre' se definió como el consumo de alimentos con alto contenido de grasa/azúcar, como refrescos, pasteles y helados. Dos ácidos benzoicos sustituidos, el ácido 3-hidroxi-4-metoxibenzoico y el ácido 3,4-dihidroxibenzoico, se asociaron con el postre (P bruto < 0,05) (Fig. 2d). Estos compuestos son intermediarios metabólicos en la degradación de vainillina e isovainillina40. El ácido neoclorogénico también se asoció significativamente con el postre (P crudo < 0,05). El ácido neoclorogénico está presente en una variedad de frutas y bayas41, incluidas las cerezas42 y los melocotones43. Otros tipos de alimentos que se incluyeron en el modelo de efectos mixtos también tenían metabolitos significativamente asociados (Tabla complementaria 4 y Figuras complementarias 1 y 2).

Se detectó cafeína en la mayoría de las muestras (Tabla complementaria 1). Es de destacar que la cafeína no se asoció significativamente con el consumo de café o té durante el período de tiempo experimental (FDR P = 0,87) (Tabla complementaria 4), probablemente porque la cafeína se absorbe rápidamente dentro de 1 h de la ingesta oral y tiene una vida media media de 4,5 h (rango 2,7-9,9 h) en el torrente sanguíneo44; sin embargo, las vías metabólicas de la cafeína se discernieron fácilmente a través del análisis de correlación de rangos de Spearman. Los seis metabolitos que se correlacionaron más fuertemente en FDR P < 10−13 con la cafeína fueron catabolitos de cafeína conocidos45,46,47, incluida la teofilina y la teobromina (Fig. 2e,f). La cafeína se metaboliza y excreta a través de varias vías, incluidas la orina48 y la bilis49. La bilis es el origen esperado de la cafeína medida en este estudio, ya que pasaron varias horas entre el consumo de bebidas y los eventos de muestreo del dispositivo. Si bien se sabe que la teobromina está presente en el chocolate, no se asoció con el consumo de postres, solo con el metabolismo de la cafeína. Por lo tanto, las correlaciones de metabolitos del tracto intestinal superior pueden permitir la reconstrucción de las vías microbianas y enzimáticas del metabolismo de los exposomas. Se necesitarían estudios dedicados en una población diversa que utilicen intervenciones dietéticas para asociar biomarcadores alimentarios específicos. Además, dado que los dispositivos preservan en gran medida la viabilidad bacteriana4, los aislados cultivados obtenidos de los dispositivos podrían usarse para confirmar las interacciones entre bacterias y metabolomas de alimentos individuales.

Los metabolitos de la dieta se asociaron con diferencias temporales durante los 2 días y los cuatro puntos de tiempo de muestreo de este estudio. Para investigar si el tiempo de muestreo o la región de muestreo tuvieron un mayor impacto en los metabolitos del intestino superior, utilizamos el análisis de varianza (ANOVA) para calcular la cantidad de metabolitos que diferían significativamente entre los cuatro tipos de dispositivos por participante, o entre los cuatro puntos de tiempo de muestreo ( después de cada comida) por participante. Las grandes diferencias en los niveles de metabolitos entre las regiones de muestreo proximal y distal a menudo fueron reemplazadas por diferencias metabólicas entre los puntos de tiempo, lo que muestra que 12 de 15 participantes tenían más metabolitos estadísticamente diferentes entre las comidas (puntos de tiempo) que entre las regiones intestinales (tipos de dispositivos) (Extended Datos Fig. 6a,b). Una inspección más detallada de las clases de compuestos que contribuyeron a estas diferencias encontró que los dipéptidos y tripéptidos (dentro de la clase química de los ácidos carboxílicos) eran la clase química más grande que distinguía entre los tipos de dispositivos, representando >70 % de todos los metabolitos significativamente diferentes en cinco participantes y >40% para otros siete participantes (Datos extendidos Fig. 7a). Para los metabolitos que diferenciaron los puntos de tiempo de muestreo, los azúcares (compuestos organooxigenados) se enriquecieron en 13 de 15 participantes (Datos extendidos Fig. 7b). De manera similar, se encontraron imidazopirimidinas, indoles e isoflavonoides más significativamente diferentes para distinguir los puntos de tiempo de muestreo que las regiones intestinales (Datos extendidos Fig. 7). Estas clases significan metabolitos dietéticos que eran diferentes debido a la variación entre los tipos de alimentos ingeridos durante las diferentes comidas, pero que no eran tan útiles para diferenciar entre regiones intestinales.

Nuestro conjunto de datos exhibió una gran variación interindividual (Datos extendidos Fig. 7). Como a los participantes no se les recetaron comidas específicas, se esperaba que la variación basada en la dieta diferenciara a los participantes y los puntos temporales. Usando el análisis discriminante multivariado (PLS-DA), identificamos diferencias en la proporción de metabolitos que fueron más importantes para diferenciar entre el intestino proximal y distal (tipos de dispositivos) y entre los 15 participantes (Datos extendidos Fig. 6b). La gran variación general entre las muestras oscureció la visualización clara de PLS-DA en función de los participantes, dispositivos o puntos de tiempo. No obstante, los 100 metabolitos que más contribuyeron a la discriminación multivariante revelaron tendencias específicas de los participantes que se explicaron mejor por los metabolitos de origen vegetal y microbiano (Datos ampliados, Fig. 6b), incluido el compuesto de pimienta capsaicina, el compuesto de linaza secoisolariciresinol y el butírico producido microbianamente. ácido y ácido propiónico (Tabla complementaria 7). Otros metabolitos que mostraron variaciones específicas de los participantes, como la N-metilhistamina, la fenetilamina, el fenilacetaldehído y el ácido succínico, pueden depender de una combinación de factores humanos, dietéticos o microbianos. En particular, el agrupamiento jerárquico separó las muestras de heces por participante, mientras que las muestras intestinales no se agruparon fuertemente por participante (Fig. 3 complementaria), quizás debido a la mayor abundancia de microbios intestinales específicos de cada individuo en las heces en relación con el intestino proximal, que era más dominada por la variabilidad en los componentes de la dieta.

Aunque la gran variación general oscureció la visualización directa de las diferencias entre individuos al usar todos los datos en las proyecciones PLS-DA, los compuestos específicos exhibieron diferencias de concentración muy grandes entre los individuos (Fig. 3). Por ejemplo, los pigmentos biliares derivados del hemo humano biliverdina y bilirrubina y la urobilina y la estercobilina producidas microbianamente variaron drásticamente entre los dispositivos para algunos participantes y también se redujeron mucho o estuvieron ausentes en participantes específicos, como la estercobilina para los participantes 10 y 15 (Fig. 3 ). Se ha propuesto que la producción de ácidos biliares secundarios utilice una vía enzimática similar a la de la producción de estercobilina50,51 y los dos participantes que tenían niveles bajos de estercobilina también mostraron una concentración reducida de ácido desoxicólico, un ácido biliar secundario (Fig. 3). Los mismos perfiles de pigmentos biliares específicos de los participantes también se observaron en muestras de heces (Datos ampliados, Fig. 8). En particular, estos dos participantes (10 y 15) fueron los únicos que informaron el uso de antibióticos en los 6 meses anteriores al estudio. Estos individuos se caracterizaron por niveles muy bajos de estercobilina, ácido desoxicólico, un subconjunto de FAHFA y sulfolípidos (Fig. 3), todos los cuales se han relacionado previamente con la microbiota intestinal10,51,52,53. Los antibióticos orales pueden afectar a la microbiota intestinal durante más de un año tras el tratamiento54. Estos datos respaldan la hipótesis de que los perfiles metabólicos reflejan diferencias en la actividad microbiana para vías específicas. No identificamos asociaciones significativas entre la abundancia de especies microbianas a partir de la cuantificación del gen 16S rRNA y los niveles de estercobilina debido al poder estadístico limitado, pero la presencia de FAHFA y sulfolípidos se asoció con la abundancia diferencial de especies microbianas específicas.

Los metabolitos incluyen pigmentos biliares, ésteres de ácidos grasos de hidroxiácidos grasos (FAHFA y AAHFA), SCFA, sulfolípidos (SL) y ácidos biliares secundarios. Las muestras se organizan por participante y se indica el consumo de antibióticos para los dos participantes que consumieron antibióticos 1 y 5 meses antes de este estudio. El color del mapa de calor varía de bajo (azul) a alto (rojo) de abundancia de metabolitos (altura máxima) o concentración (en nanogramos por mililitro) de ácidos biliares. Los valores mínimo y máximo se utilizan para establecer la escala de colores para cada metabolito (cada fila).

Los FAHFA se identificaron por primera vez hace 10 años. Son biológicamente activos y regulan la fisiología55,56. Los ácidos grasos acil α-hidroxilo (AAHFA) son un subconjunto específico de FAHFA con un enlace lípido α que se descubrió hace solo 2 años53. Identificamos 88 FAHFA en este estudio (Tabla complementaria 1). En particular, cuatro FAHFA específicos exhibieron diferencias altamente consistentes entre los participantes y todos estos FAHFA son enlaces de un esqueleto de ácido graso hidroxilo de cadena larga esterificado con restos de cadena corta C3 o C4. Tres de estos lípidos bioactivos están esterificados en la posición α (AAHFA 4:0/22:0, AAHFA 3:0/22:0 y AAHFA 3:0/24:0) y uno está esterificado en otra parte del esqueleto (FAHFA 3:0/23:0). Nueve participantes exhibieron con frecuencia altos niveles de estos FAHFA, mientras que seis participantes produjeron cantidades muy pequeñas o indetectables (Fig. 3). Como los niveles indetectables no se pueden usar para las estadísticas de ANOVA, no realizamos pruebas de significación. Se observaron las mismas tendencias individuales específicas en las muestras de heces (Datos ampliados, Fig. 8). El único otro FAHFA detectado con frecuencia con una cadena lateral C3 o C4 y un ácido graso de cadena larga fue AAHFA 16:0/4:0, que no siguió la misma tendencia individual específica que los cuatro FAHFA discutidos anteriormente. Cabe destacar que los bajos niveles de ácidos grasos de cadena larga o sustratos SCFA, propiónico (C3:0) y ácido butírico (C4:0), no explicaron las diferencias observadas en estos FAHFA de cadena corta en muestras intestinales o de heces (Fig. 3 y datos ampliados Fig. 9). Por lo tanto, investigamos si bacterias específicas estaban asociadas con la presencia o ausencia de los cuatro FAHFA de interés. Dos taxones, una especie del género Blautia más estrechamente relacionada filogenéticamente con Blautia obeum y proteobacterias relacionadas con Bilophila wadsworthia, se asociaron significativamente con la detección de estos FAHFA (Tabla complementaria 8). B. obeum es un productor conocido de SCFA57, lo que sugiere que la producción de constituyentes de acilo graso de cadena corta podría ser un factor impulsor de la producción de AGAA específicos de cada individuo; sin embargo, FAHFA 4:0/16:0 no mostró la misma tendencia individual específica, lo que sugiere que la especie Blautia puede producir específicamente FAHFA con ésteres de ácido propiónico y butírico de acilos grasos de cadena muy larga hidroxilados (22:0 y 23 :0) y no de las formas hidroxilo de los ácidos grasos más abundantes, C16–18. Se ha demostrado que un grupo de FAHFA químicamente relacionado mejora la homeostasis de la glucosa, estimula la sensibilidad a la insulina y tiene efectos antiinflamatorios55. Por lo tanto, nuestros hallazgos tienen implicaciones potenciales para la salud además de proporcionar un vínculo entre la química intestinal y los niveles de FAHFA en humanos.

Aquí, informamos la detección de sulfolípidos en muestras humanas. Estos lípidos se agregaron recientemente a las bibliotecas lipidómicas58, lo que llevó al descubrimiento de que se producen microbianamente en el tracto intestinal del ratón y se relacionan con fenotipos proinflamatorios y antiinflamatorios59,60,61. En muestras de dispositivos intestinales, detectamos sulfolípidos con fuertes tendencias interindividuales independientemente del punto de muestreo (comidas), lo que sugiere que los sulfolípidos se produjeron microbianamente en algunos individuos, pero no en otros. Los dos participantes que habían recibido antibióticos previamente mostraron niveles mucho más bajos de sulfolípidos que todos los demás individuos (Fig. 3), lo que sugiere que el tratamiento con antibióticos puede haber eliminado a los productores microbianos. En particular, los sulfolípidos también estuvieron ausentes en muestras específicas de otros participantes, lo que nos llevó a examinar las asociaciones de sulfolípidos con taxones bacterianos. Diez taxones se enriquecieron significativamente en muestras que contenían sulfolípidos, incluido un miembro de la familia Desulfovibrionaceae (Tabla complementaria 8), una familia que se ha asociado con la colitis ulcerosa62. También se enriquecieron dos miembros de Bacteroidetes, un filo con conocidos productores de sulfolípidos60. Las implicaciones para la salud de los niveles de sulfolípidos en humanos no se comprenden bien. Recientemente se demostró que los sulfolípidos aumentan las respuestas inflamatorias en los macrófagos, pero disminuyen la inflamación en presencia de lipopolisacáridos63. Se requieren más investigaciones para determinar la relación de los sulfolípidos con la salud humana.

Este trabajo proporciona un informe de las diferencias del metaboloma en el tracto intestinal superior en participantes humanos sanos que utilizan un dispositivo de muestreo ingerible no invasivo. Nuestros resultados abren la puerta a futuros estudios detallados in vivo sobre la digestión y las enfermedades intestinales. Como era de esperar, el metaboloma de las heces era muy distinto al del intestino. Por lo tanto, las heces no pueden servir como un sustituto del tracto intestinal intestinal, sino solo del contenido colónico (en el mejor de los casos). Incluso dentro del tracto intestinal, >50% de los metabolitos anotados exhibieron niveles significativamente diferentes entre las ubicaciones proximales y distales. Un objetivo importante para la investigación futura es caracterizar el efecto de los antibióticos en las bacterias intestinales productoras de sulfolípidos, estercobilinas y AAHFA de cadena larga y las consecuencias de tales alteraciones en la salud y la enfermedad. La alteración de estas bacterias por los antibióticos puede estar relacionada con la incidencia y la etiología de la inflamación, la diabetes y la enfermedad inflamatoria intestinal55,60,63. En consecuencia, será importante descubrir la dinámica y los mecanismos de repoblación de individuos tratados con antibióticos con estos microbios.

En nuestro estudio complementario relacionado4, utilizamos las mismas muestras de dispositivos para estudiar ampliamente la variación en el entorno intestinal utilizando varios enfoques ómicos. Al igual que los hallazgos sobre los metabolomas informados en este estudio, encontramos una inducción de profago más pronunciada en las muestras intestinales en comparación con las heces y que el proteoma del huésped y los perfiles de ácidos biliares variaban a lo largo de los intestinos y eran muy distintos de los de las heces4. Complementando las grandes diferencias en péptidos y aminoácidos entre las ubicaciones intestinales proximales y distales que se informan aquí, en nuestro estudio complementario mostramos que las concentraciones de ácidos biliares conjugados microbianamente mostraron tendencias dependientes de aminoácidos que no eran evidentes en las heces. En conjunto, estos estudios ilustran colectivamente la utilidad de tomar muestras directamente de los intestinos, lo que debería mejorar nuestra comprensión de la relación íntima entre los huéspedes humanos y sus microbios comensales.

Como estudio piloto, nuestro estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, será necesario un mayor número de participantes para sacar conclusiones sobre el rango del metabolismo intestinal dentro y entre las poblaciones humanas y estudios más amplios también podrían acomodar asociaciones más detalladas en todo el microbioma de bacterias específicas o familias bacterianas con conversiones metabólicas. En segundo lugar, solo dos participantes informaron el uso de antibióticos, por lo tanto, el vínculo potencial entre el uso de antibióticos y la interrupción del metabolismo de los sulfolípidos y los FAHFA debe fortalecerse en estudios futuros. En tercer lugar, el análisis de la variación temporal se limitó a dos puntos de tiempo por día en dos días consecutivos, por lo que los cambios en la composición metabólica o microbiana a lo largo del tiempo no se evaluaron por completo. En cuarto lugar, los vínculos entre la composición de la microbiota del intestino superior y la variabilidad de las enfermedades, como el crecimiento excesivo de bacterias en el intestino delgado, necesitarán investigaciones específicas y separadas. A pesar de estas limitaciones, nuestros hallazgos demuestran que el uso de dispositivos de muestreo no invasivos, en combinación con la metabolómica y la genómica, tiene un potencial sustancial para permitir estrategias de intervención y prevención más precisas para abordar estudios nutricionales y enfermedades humanas.

En una publicación complementaria relacionada4, usamos el mismo texto para describir el dispositivo de muestreo de cápsulas (CapScan, Envivo Bio). Un CapScan consta de una vejiga de recolección elástica hueca tapada por una válvula unidireccional4. Para preparar el dispositivo para el envasado, se vacía la vejiga de recogida, se dobla por la mitad y se envasa dentro de una cápsula soluble de 6,5 mm de diámetro y 23 mm de longitud, sobre la que se aplica un recubrimiento entérico. La cápsula y el recubrimiento entérico están diseñados para evitar la contaminación de la vejiga de recolección por microbios orofaríngeos y gástricos durante la ingestión. El recubrimiento entérico y la cápsula se desintegran cuando el dispositivo alcanza el pH objetivo, que es pH 5,5 para el tipo 1, pH 6 para el tipo 2 y pH 7,5 para los tipos 3 y tipo 4, y el tipo 4 también tiene un recubrimiento de retardo de tiempo para sesgar la recolección. hacia el colon ascendente. Después de la desintegración del recubrimiento entérico, la vejiga de recolección se despliega y se expande en un tubo de 6 mm de diámetro y 33 mm de largo, aspirando así hasta 400 µl de contenido luminal intestinal a través de la válvula unidireccional. La válvula unidireccional mantiene la integridad de la muestra recolectada dentro de la vejiga de recolección a medida que el dispositivo se mueve a través del colon y se expone a las heces.

En una publicación complementaria relacionada4, usamos el mismo texto para describir el diseño del estudio. Cada participante ingirió simultáneamente conjuntos de cuatro dispositivos, cada uno con revestimientos distintos para apuntar a las regiones proximal a medial del intestino delgado (tipos de revestimiento 1 y 2) y regiones más distales (tipos de revestimiento 3 y 4). Después del muestreo, los dispositivos se pasaron en las heces a recipientes de recolección de muestras y se congelaron inmediatamente. Después de la recolección, el personal del estudio descongeló las heces y recuperó los dispositivos. Para la extracción de muestras, las vejigas de recolección elásticas se enjuagaron con alcohol isopropílico al 70 % y se pincharon con una aguja hipodérmica estéril unida a una jeringa de 1 ml. Las muestras se transfirieron a tubos de microcentrífuga y se midió el pH con una sonda de pH InLab Ultra Micro ISM (Mettler Toledo). Para el análisis metabolómico, se centrifugó una alícuota de 40 µl durante 3 min a 10 000 g para recoger el sobrenadante. El resto de la muestra se congeló hasta su descongelación para la extracción de ADN.

En una publicación complementaria relacionada4, usamos el mismo texto para describir el diseño del estudio. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Grupo WIRB-Copernicus (estudio n.º 1186513) y se obtuvo el consentimiento informado de cada participante. Se seleccionaron voluntarios sanos para excluir a los participantes que padecían afecciones gastrointestinales clínicamente detectables o enfermedades que podrían interferir con la adquisición e interpretación de datos.

Los participantes cumplieron con todos los siguientes criterios para la inclusión en el estudio: (1) individuos entre las edades de 18 y 70 años; (2) riesgo de clase de estado físico de la Sociedad Estadounidense de Anestesiólogos de 1 o 2; (3) para mujeres en edad fértil, una prueba de embarazo en orina negativa dentro de los 7 días de la visita de selección y disposición a usar anticonceptivos durante todo el período de estudio; y (4) fluidez en inglés, comprensión del protocolo del estudio y capacidad para proporcionar un consentimiento informado por escrito, además de cumplir con los requisitos del estudio.

Los participantes con cualquiera de las siguientes condiciones o características fueron excluidos del estudio: (1) antecedentes de cualquiera de los siguientes: cirugía gástrica o esofágica previa, incluyendo bandas gástricas o cirugía bariátrica, obstrucción intestinal, obstrucción de la salida gástrica, diverticulitis, enfermedad inflamatoria intestinal , ileostomía o colostomía, cáncer gástrico o esofágico, acalasia, divertículo esofágico, disfagia activa u odinofagia o uso activo de medicamentos para cualquier condición gastrointestinal; (2) embarazo o embarazo planificado dentro de los 30 días desde la visita de selección o la lactancia; (3) cualquier forma de abuso o dependencia de sustancias activas (incluido el abuso de drogas o alcohol), cualquier trastorno médico o psiquiátrico inestable o cualquier condición crónica que pueda, en opinión del investigador, interferir con la realización del estudio; o (4) una condición clínica que, a juicio del investigador, podría potencialmente representar un riesgo para la salud del individuo mientras participa en el estudio.

Quince individuos sanos se inscribieron en este estudio y cada uno se tragó al menos 17 dispositivos en el transcurso de 3 días. El tamaño de la muestra se eligió para evaluar la variación general en el tracto intestinal humano. Las instrucciones diarias incluían las siguientes pautas: registrar todos los alimentos y el tiempo que se consumieron a lo largo del día; si hace ejercicio, hágalo por la mañana; desayunar y almorzar como de costumbre; trague un juego de cuatro dispositivos 3 h después del almuerzo con hasta dos tercios de taza de agua; no coma ni beba nada durante al menos 2 h después de tragar los dispositivos; si tiene hambre después de 2 h, coma un refrigerio ligero (hasta 200 calorías); no tome ninguna bebida con cafeína después del almuerzo hasta la mañana siguiente; recoger todas las heces a partir de las 6 h después de tragar este conjunto de dispositivos hasta las 48 h después de tragar el siguiente conjunto de dispositivos; cenar como de costumbre al menos 6 h después del almuerzo; trague un conjunto de cuatro dispositivos CapScan 3 h después de la cena con dos tercios de taza de agua; y después de tragar este conjunto, no coma ni beba nada hasta la mañana. El consumo de alcohol y los contenidos de la dieta no estaban restringidos. Todos los dispositivos ingeridos se recuperaron y no se informaron eventos adversos durante el estudio. En total, 274 dispositivos de cápsula proporcionaron material suficiente para el análisis metabolómico y 225 proporcionaron el volumen o el número suficiente de lecturas de secuenciación (>2500) para el análisis genómico. Cada evacuación intestinal durante el estudio fue congelada inmediatamente por el participante a -20 °C. El participante 1 proporcionó muestras adicionales para evaluar la replicabilidad. Se analizaron un total de 333 muestras intestinales y de heces con métodos de metabolómica.

La preparación de la muestra se realizó mediante una extracción bifásica64 con agua, metanol y metil terc-butil éter (MTBE) para separar los metabolitos polares y no polares. El sobrenadante del dispositivo de cápsula y las muestras de heces se prepararon por separado porque las muestras del dispositivo eran líquidas y las muestras de heces eran sólidas. Para cada muestra de sobrenadante, se tomaron alícuotas de 10 µl en un pocillo de una placa de 96 pocillos de preparación de muestra profunda en un orden aleatorio predeterminado. Las muestras se extrajeron una placa de 96 pozos a la vez y todos los pasos se llevaron a cabo a 4 °C a menos que se especifique lo contrario. Entre cada diez muestras experimentales se preparó un blanco de método y una muestra de control de calidad externo. Los espacios en blanco usaron 10 µl de agua de grado LC-MS en lugar de la muestra y las muestras de control de calidad usaron 10 µl de muestra agrupada del contenido del tracto gastrointestinal humano de estudios no relacionados. A continuación, se añadieron a cada pocillo 170 µl de metanol que contenía SPLASH LIPIDOMIX Mass Spec Standard (Avanti) y la placa se termoselló con papel aluminio, se agitó vigorosamente durante 30 s a temperatura ambiente, se destapó y se añadieron 490 µl de MTBE. A continuación, la placa se volvió a sellar con calor, se agitó vigorosamente durante 30 s a temperatura ambiente y se agitó durante 5 min en un agitador orbital. Se quitó el sello de aluminio y se agregaron 150 µl de agua de grado LC-MS a cada pocillo. La placa se agitó durante 30 s a temperatura ambiente y se centrifugó a 708 g durante 12 min. Se retiró la lámina de la placa de pocillos profundos y se transfirieron dos alícuotas de 180 µl de la fase superior a dos placas Vanquish LC de 96 pocillos utilizando una pipeta de 12 canales. A continuación, se transfirieron dos alícuotas de 50 µl de la fase acuosa a otras dos placas Vanquish LC de 96 pocillos. Todas las placas de 96 pocillos se secaron completamente al vacío a temperatura ambiente, se sellaron con calor con papel de aluminio y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis. Cada muestra de heces se preparó mezclándola con una espátula y se transfirieron 5 ± 1 mg a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. A continuación, se añadieron 225 µl de metanol que contenía el patrón de espectrometría de masas SPLASH LIPIDOMIX (Avanti) a todos los tubos de microcentrífuga y los tubos se agitaron con vórtex durante 10 s a temperatura ambiente. Se añadieron dos bolas de acero inoxidable de 3 mm y 750 µl de MTBE a cada tubo y las muestras se homogeneizaron en un Geno/Grinder (SPEX) a 1500 Hz durante 1 min. A continuación, se añadieron 188 µl de agua a cada tubo y cada tubo se agitó durante 30 s a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 14.000 g durante 2 min a temperatura ambiente. Se transfirieron dos alícuotas de 180 µl de la fase orgánica a dos placas de 96 pocillos. Se transfirieron dos alícuotas de 50 µl de la fase acuosa a dos placas de 96 pocillos. Todas las placas se secaron por completo en un evaporador rotatorio al vacío, se sellaron con calor con papel de aluminio y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis.

Las muestras de las alícuotas de la fase acuosa de la preparación de la muestra se extrajeron de -80 °C y se añadieron a cada pocillo 35 µl de acetonitrilo:agua 8:2 que contenía 29 estándares internos sintéticos y etiquetados isotópicamente, incluido CUDA65. A continuación, las placas de 96 pocillos se sellaron con papel aluminio, se agitaron vigorosamente durante 30 s a temperatura ambiente, se sonicaron en un baño de agua durante 5 min a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 15 min a 708 g. Las placas se almacenaron en un muestreador automático a 4 °C hasta el análisis (el tiempo máximo de almacenamiento en el muestreador automático fue de 48 h). LC-MS/MS se realizó con un Vanquish LC (Thermo Scientific) acoplado a un espectrómetro de masas con trampa de iones orbital QExactive HF+ (Thermo Scientific). La separación cromatográfica se realizó con una columna Acquity UPLC BEH Amide de Waters (150 mm de longitud × 2,1 mm de diámetro interno (di); 1,7 µm de tamaño de partícula) con una precolumna de 5 mm (5 mm de longitud × 2,1 mm de di; 1,7- tamaño de partícula µm). La fase móvil A era 100% agua y B era acetonitrilo:agua 95:5. Ambas fases móviles se modificaron con formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,125%. El caudal fue de 400 µl min−1, la temperatura de la columna fue de 45 °C y el volumen de inyección fue de 3 µl. El gradiente de LC fue 100 % fase móvil B de 0 a 2 min, 70 % B por 7,7 min, 40 % B por 9,5 min, 30 % por 10,25 min y volvió a 100 % B por 12,75 min para volver a equilibrarse hasta los 17 min . Todos los cambios de gradiente de fase móvil fueron lineales. Se utilizó acetonitrilo:agua 1:1 como disolvente de lavado de agujas antes y después de la inyección de la muestra. Las condiciones de la fuente de ionización por electropulverización calentada (HESI) fueron las siguientes: flujo de gas envolvente 50, flujo de gas auxiliar 13, flujo de gas de barrido 3, temperatura capilar 263 °C, nivel de RF de lente S 50, temperatura del calentador de gas auxiliar 425 °C y voltaje de aguja 3500 V y −3500 V para modo de ionización positiva y negativa, respectivamente. Los espectros se recopilaron con adquisición MS/MS (DDA) dependiente de los datos para los cuatro iones principales. Los escaneos de MS se recopilaron con una potencia de resolución de 60 k de 60 a 900 m/z, un objetivo AGC de 106 iones y un tiempo máximo de acumulación de 100 ms. Los espectros de MS/MS se recolectaron con un poder de resolución de 15 k, una ventana de aislamiento de 1 Da, un tiempo máximo de acumulación de 50 ms, una ventana de exclusión dinámica de 3 s, (N) CE escalonado de 20, 30 y 60 para fragmentación y 8 × 103 Objetivo AGC. Todos los espectros se almacenaron en modo centroide. Se adquirieron tres rondas de MS/MS de exclusión iterativa para cada muestra de control de calidad agrupada. Inmediatamente después del análisis, las placas se secaron al vacío, se sellaron con papel aluminio y se almacenaron a -80 °C.

Las placas de muestra de las alícuotas de la fase orgánica se retiraron de -80 °C y se añadieron 50 µl de acetonitrilo/tolueno 9:1 a cada pocillo. Luego, las placas se sellaron con papel de aluminio, se agitaron vigorosamente durante 30 s a temperatura ambiente, se sonicaron en un baño de agua durante 5 min a temperatura ambiente, se centrifugaron durante 15 min a 708 g y se transfirieron a un muestreador automático mantenido a 4 °C hasta el análisis (almacenamiento máximo). el tiempo en el automuestreador antes del análisis fue de 48 h). El análisis LC-MS/MS de lipidómica utilizó un sistema LC Thermo Scientific Vanquish acoplado a un espectrómetro de masas con trampa de iones orbital Thermo Scientific QExactive HF+. La separación cromatográfica utilizó una columna Waters Acquity UPLC CSH C18 (100 mm de longitud × 2,1 mm de d.i.; tamaño de partícula de 1,7 µm) con una precolumna (5 mm de longitud × 2,1 mm de d.i.; tamaño de partícula de 1,7 µm). La fase móvil A era acetonitrilo:agua 9:1 y B era IPA:acetonitrilo 8:2. Para la ionización por aspersión de electrones (ESI) en modo positivo, las fases móviles se modificaron con formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1%. Para ESI de modo negativo, las fases móviles se modificaron con acetato de amonio 10 mM. El caudal fue de 600 µl min−1, la temperatura de la columna fue de 65 °C y el volumen de inyección fue de 5 µl. El gradiente de fase móvil fue 15 % B de 0 a 0,6 min, 30 % B de 2 min, 48 % B de 2,5 min, 82 % B de 11 min, 99 % B de 11,5 a 12 min y 15 % B de 12,1 a 14,2 minutos Las condiciones de la fuente HESI fueron las siguientes: flujo de gas envolvente 55, flujo de gas auxiliar 15, flujo de gas de barrido 3, temperatura capilar 275 °C, nivel de RF de lente S 50, temperatura del calentador de gas auxiliar 450 °C y voltaje de aguja 3500 V y −3500 V para modo de ionización positivo y negativo, respectivamente. Se adquirieron espectros DDA MS/MS para los cuatro iones principales. Los escaneos de MS se recopilaron con una potencia de resolución de 60 k de 120 a 1700 m/z, un objetivo AGC de 106 iones y un tiempo máximo de acumulación de 100 ms. Los espectros de MS/MS se recopilaron con un poder de resolución de 15 k, una ventana de aislamiento de 1 Da, una energía de colisión normalizada de 20, 30 y 60, una ventana de exclusión dinámica de 2 s, un objetivo de AGC de 8 × 103 y un tiempo de acumulación máximo de 50 ms. Los espectros se almacenaron en modo centroide. Se adquirieron tres rondas de MS/MS de exclusión iterativa para cada muestra de control de calidad agrupada. Inmediatamente después de analizar todas las muestras, las placas se secaron al vacío, se sellaron con papel aluminio y se almacenaron a -80 °C.

Las muestras secas en fase acuosa como se describe anteriormente se retiraron de -80 °C y se añadieron a cada pocillo 10 µl de 40 mg ml−1 de clorhidrato de metoxiamina en piridina. Las placas se sellaron y se agitaron a 30 °C durante 90 min. Se retiró la lámina y se añadieron a cada pocillo 90 µl de N-metil-N-trimetilsilil trifluoroacetamida (que contenía estándares internos de ésteres metílicos de ácidos grasos C8-C30) y las placas se agitaron durante 30 min a 37 °C. A continuación, la placa se centrifugó a 2400 g durante 15 min a temperatura ambiente. Se retiró la lámina y se transfirieron 90 µl de sobrenadante a viales de vidrio con tapa a presión con inserto de vidrio y se cerraron a presión. Las muestras se analizaron dentro de las 48 h posteriores a la derivatización. El análisis GC-MS se llevó a cabo como se describió previamente66. Brevemente, se analizaron 0,5 µl en modo splitless a través de un GC Agilent 6890 equipado con una columna RTx-5Sil MS (30 m × 0,25 mm de d.i., película de dimetildifenil polisiloxano de 0,25 µm 95:5). La cromatografía utilizó helio a 1 ml min−1 y un gradiente de temperatura de 50 °C a 275 °C. El análisis de MS se realizó utilizando un espectrómetro de masas Leco Pegasus III TOF. Los espectros se recogieron a 17 espectros por segundo con 70 eV EI. Los archivos de datos se preprocesaron en el software Leco ChromaTOF y se analizaron más a fondo utilizando la tubería de procesamiento de datos GC-MS automatizada BinBase67 con FiehnLib para la coincidencia de espectros y tiempos de retención.

Los ácidos biliares se identificaron y cuantificaron como se informó anteriormente4. Brevemente, las placas de muestras de fase acuosa secas del análisis ESI+ de cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) se retiraron de un congelador de -80 °C y se disolvieron en 60 µl de solvente de procesamiento de ácido biliar (metanol ACN 1:1 que contenía 100 ng ml−1 de cinco isotópicamente patrones internos de ácidos biliares marcados). Las placas se agitaron durante 30 s y se sonicaron en un baño de agua durante 5 min. Todas las muestras se diluyeron 30 veces en disolvente de ensayo con ácido biliar. Todas las placas se centrifugaron a 708 g durante 15 min a 4 °C y se almacenaron en un muestreador automático Vanquish a 4 °C hasta el análisis. Se preparó una curva estándar de nueve puntos entre 0 y 1500 ng ml−1 y se analizó con muestras. Se utilizó un espectrómetro de masas Vanquish UPLC y Altis QqQ (Thermo Fisher Scientific) para el análisis LC-MS/MS específico. Se utilizó una columna Acquity BEH C18 (100 mm × 2,1 mm de d.i., tamaño de partícula de 1,7 µm; Waters) con la fase móvil A de agua y B de acetonitrilo, ambas con ácido fórmico al 0,1 %. Se utilizaron el software Skyline y los scripts R personalizados para procesar y cuantificar los analitos de ácidos biliares.

La cuantificación de SCFA se realizó mediante derivatización con N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) según un protocolo informado anteriormente68. Brevemente, se transfirieron 10 µl de sobrenadante intestinal a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo prellenado con 50 µl de agua de grado LC-MS que contenía patrones internos SCFA marcados con deuterio y 10 µl de ácido clorhídrico al 37 %. A continuación, se añadieron a cada tubo 100 µl de MTBE que también contenía patrones internos de SCFA marcados con deuterio y los tubos se agitaron en una placa agitadora rotatoria durante 30 min a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 14 000 g durante 2 min y se transfirieron 20 µl de MTBE (capa superior) a un vial de GC-MS con tapa engarzada equipado con un inserto de baja recuperación. Luego, se añadieron 5 µl de MTBSTFA a cada vial, que luego se selló. Los viales se agitaron en una placa de agitación orbital durante 30 min a 80 °C, se enfriaron a temperatura ambiente y se analizaron mediante GC-MS. Se utilizó un GC Agilent 6890 acoplado a un espectrómetro de masas TOF Leco Pegasus IV con una columna capilar DB5 DuraGuard (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm). Después de eso, se inyectó 1 µl con el modo dividido 1:10 habilitado, caudal de helio de 1,2 ml min−1, temperatura aumentada de 50 °C a 290 °C durante 20,8 min y velocidad de escaneo de 17 espectros por min de 50 a 550 m/z. Se analizó una curva estándar de seis puntos entre 1 y 100 µg ml−1 por cada 80 muestras y se analizaron muestras en blanco entre cada diez muestras experimentales. Las mezclas de muestras y curvas estándar se prepararon dentro de las 24 h posteriores al análisis GC-MS. Los datos se convirtieron al formato Agilent (.d) y se procesaron con Agilent MassHunter Quant vB09.00. Se usaron curvas estándar lineales de seis puntos usando la proporción de analito a estándar interno para cuantificar SCFA en muestras experimentales.

Se utilizó MS-DIAL v.4.80 (ref. 58) para procesar datos LC-MS/MS no específicos. Los conjuntos de datos HILIC LC–MS/MS (ESI+ y ESI-) y lipidómicos (ESI+ y ESI-) se procesaron con parámetros optimizados manualmente (Tabla complementaria 9). Se informó la altura máxima para todos los análisis no dirigidos. Los espectros de MS/MS experimentales se compararon con los de MassBank of North America, así como con las bibliotecas espectrales NIST20 para los análisis HILIC y todos los espectros de MS/MS de referencia de lípidos de MS-DIAL se usaron para los análisis de lipidómica. La información del tiempo de retención para HILIC y lipidómica de estándares auténticos ejecutados en condiciones de cromatografía idénticas se utilizó como otra línea de evidencia para la anotación de metabolitos. Las anotaciones de metabolitos se basaron en una coincidencia de masa precisa con el tiempo de retención y/o una coincidencia de MS/MS con un espectro de biblioteca. La sustracción en blanco se realizó conservando las características de LC-MS para las cuales la intensidad máxima de una muestra experimental fue al menos diez veces más alta que el promedio de los blancos del método, junto con una mayor reducción de datos como se describe en la Tabla complementaria 2. El paso final de el procesamiento de datos fue una investigación manual de las características anotadas para la calidad de coincidencia MS/MS, la calidad máxima, la alineación máxima y la eliminación de fragmentos en la fuente mediante la correlación entre características con un tiempo de retención cercano para la identificación de fragmentos en la fuente. Cuando múltiples metabolitos de bibliotecas espectrales coincidían con una MS/MS experimental, la coincidencia se registraba como una coincidencia MS/MS no única (Tabla complementaria 1). Los tiempos de retención previstos calculados con Retip69 se usaron como una línea de evidencia adicional para señalar las anotaciones de baja calidad.

El ADN se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN microbiano (QIAGEN)70 y 50 µl de un dispositivo de cápsula o 100 mg de heces. Los amplicones de ARNr 16S se generaron utilizando pares de cebadores 515F/806R recomendados por Earth Microbiome Project y 5PRIME HotMasterMix (Quantabio, 2200410) con el siguiente programa en un termociclador: 94 °C durante 3 min, 35 ciclos de 94 °C durante 45 s, 50 °C durante 60 s y 72 °C durante 90 s, seguido de 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR se limpiaron, cuantificaron y combinaron con el kit de limpieza de PCR UltraClean 96 (QIAGEN, 12596-4) y el kit de ensayo de alta sensibilidad Quant-iT dsDNA (Invitrogen, Q33120). Las muestras se secuenciaron con lecturas de 300 pb en un MiSeq (Illumina). Los datos de la secuencia se desmultiplexaron utilizando el algoritmo Illumina bcl2fastq en las instalaciones de Chan Zuckerberg BioHub Sequencing. El procesamiento posterior se realizó utilizando el entorno informático estadístico R v.4.0.3 (ref. 71) y DADA2 como se describió anteriormente utilizando pseudo-pooling72. Los parámetros truncLenF y truncLenR se establecieron en 250 y 180, respectivamente. La taxonomía se asignó utilizando la base de datos Silva rRNA v.132 (ref. 73). Las muestras con >2500 lecturas se conservaron para los análisis.

Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando R71. Los LMM se realizaron utilizando los paquetes lmerTest y lme4 R. Para examinar las diferencias espaciales a lo largo del intestino, aplicamos LMM que representaban la ubicación del muestreo (proximal (tipos de dispositivos 1 y 2) o distal (tipos de dispositivos 3 y 4)), ocho tipos de alimentos clasificados a partir de registros de alimentos (proteínas vegetales y animales (carne , huevo y pescado), cereales (arroz, pasta, pan y otros cereales), café o té, postre o alcohol (cerveza, vino o agua mineral con alcohol), lácteos y frutas) y consumo de antibióticos en los últimos 6 meses como variables de efectos fijos e inter -variación individual como variable de efecto aleatorio (Tablas complementarias 3 y 4). Los tipos de alimentos se asignaron manualmente a partir de los registros de alimentos escritos de los participantes mediante formularios de evaluación personalizados. Las abundancias de metabolitos se transformaron en log10 y los valores faltantes se trataron como ceros, seguidos de una escala de -1 y 1 antes del análisis LMM. Se utilizó una corrección de Benjamini-Hochberg74 para dar cuenta de las pruebas de hipótesis múltiples. Las correlaciones entre la microbiota (abundancia de variantes de secuencia de amplicón a escala log2) y los metabolitos (abundancia de metabolitos a escala log10) se calcularon en el nivel de variante de secuencia de amplicón utilizando las correlaciones de Pearson. Se utilizó un análisis de abundancia diferencial utilizando Limma-Voom para FAHFA y sulfolípidos en un análisis de presencia/ausencia. Solo se consideraron taxones con una abundancia diferencial absoluta > 0,75 y P < 0,1 corregido por Benjamini-Hochberg. Se usó ChemRICH75 para calcular las estadísticas de enriquecimiento. La agrupación se realizó utilizando la función hclust con la matriz de correlación de rango de Spearman del metabolito calculada utilizando la función cor en R y la distancia euclidiana calculada con la función as.dist en R. PLS-DA y el análisis de componentes principales (PCA) se realizaron con el ropls paquete en R76. Los modelos PLS-DA para distinguir el participante y el tipo de dispositivo se evaluaron mediante una validación cruzada de siete veces. Utilizando de 20 a 1000 permutaciones aleatorias de etiquetas de clase realizadas por el paquete ropls R para probar el sobreajuste, los modelos mantuvieron Q2Y > 0,15 y P < 0,05 (ref. 77). Las funciones de LC-MS/MS no dirigidas (HILIC y RP ESI+/-) se normalizaron a la suma de los estándares internos para cada plataforma, que ha demostrado ser más sólida que las normalizaciones a compuestos individuales78. Esta normalización se realizó dividiendo cada característica de LC-MS por la suma de las alturas de los picos del estándar interno para esa muestra78,79. Los datos de GC-MS se normalizaron a la intensidad sumada de todos los metabolitos anotados como se discutió ampliamente en los protocolos publicados80. Este método aborda las diferencias específicas de los métodos de GC, recientemente llamado normalización al área de pico útil total81. Los datos de control de calidad agrupados se encontraron en un grupo denso en comparación con CapScan y muestras de heces (Datos extendidos, Fig. 1). Durante la fusión de conjuntos de datos, los metabolitos detectados por múltiples ensayos se simplificaron para mantener solo los datos de un instrumento, con preferencia por retener los datos del ensayo con menor variación técnica (% de coeficiente de variación del control de calidad combinado). Los metabolitos que se detectaron solo en un único ensayo permanecieron en el conjunto de datos, independientemente del porcentaje de coeficiente de variación del control de calidad combinado (Tabla complementaria 1). Para cada metabolito antes de PCA y PLS-DA, se realizó la transformación Log10 y la imputación de valor cero utilizando una décima parte de la altura máxima mínima informada para las características no detectadas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de espectrometría de masas sin procesar están disponibles en Metabolomics Workbench (https://www.metabolomicsworkbench.org/) en los estudios ST002073, ST002075, ST002407, ST002409 y ST002411. Las lecturas de secuenciación 16S y metagenómica están disponibles en NCBI bajo BioProject PRJNA822660. La taxonomía se asignó utilizando la base de datos Silva rRNA v.132 (https://www.arb-silva.de/). Los espectros de masas se anotaron utilizando las bibliotecas públicas de MassBank of North America (https://massbank.us/) y las bibliotecas NIST20 con licencia de NIST. Los guiones se archivan en Zenodo (https://zenodo.org/record/7659119#.ZBGhMh_P23A).

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Nam, SL, de la Mata, AP, Dias, RP & Harynuk, JJ Hacia la estandarización de las estrategias de normalización de datos para mejorar los estudios de metabolómica urinaria por GC× GC-TOFMS. Metabolitos 10, 376 (2020).

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J. Wells y Z. Tippins ayudaron en los análisis de espectrometría de masas en el Centro de Metabolómica de la Costa Oeste. Se utilizó el código R de D. Barupal descargado de su sitio de GitHub para las evaluaciones de ChemRICH. C. Brydges consultó sobre análisis de regresión estadística. Este estudio fue financiado por USDA 2021-67017-35783 a OF, Institutos Nacionales de Salud (NIH) subvención RM1 GM135102 a KCH y Fundación Nacional de Ciencias subvención EF-2125383 a KCH y salario para JF fue proporcionado por subvenciones NIH R01 AT010216 y NIH U19 AG023122. Este material también se basa en el trabajo apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la subvención no. 1936687 a DSJG fue apoyado por una Beca del Decano de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford y por NIH F32 DK130574. DAR cuenta con el apoyo de Thomas C. y Joan M. Merigan Endowment de la Universidad de Stanford. KCH y DAR son investigadores de Chan Zuckerberg Biohub.

Centro de Metabolómica de la Costa Oeste, Universidad de California, Davis, CA, EE. UU.

Jacob Folz, Juan Montes Morales & Oliver Fiehn

Departamento de Genética, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

rebeca neal culver

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Jessica Grembi y David A. Relman

Centro de Neurogastroenterología y Motilidad de Silicon Valley, Mountain View, CA, EE. UU.

Jorge Triadafilopoulos

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

David A. Relman y Kerwyn Casey Huang

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, EE. UU.

David A. Relman y Kerwyn Casey Huang

Sección de Enfermedades Infecciosas, Asuntos de Veteranos Sistema de Atención Médica de Palo Alto, Palo Alto, CA, EE. UU.

David A. Relman

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Kerwyn Casey Huang

Envivo Bio, San Francisco, CA, USA

de Sharon

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OF, KCH y DS diseñaron el estudio. JF adquirió y procesó los datos del metaboloma, con la asistencia de JMMJF realizó análisis estadísticos y produjo figuras y tablas. GT reclutó participantes y obtuvo consentimientos y muestras. KCH, RNC, JG y DAR adquirieron, procesaron y analizaron datos de microbiomas. JF y OF escribieron el manuscrito con contribuciones de DS, KCH, GT y RNC Todos los autores aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Oliver Fiehn.

DS es un empleado y tiene una participación accionaria en Envivo Bio, una empresa con interés en el tracto gastrointestinal humano. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

El estudio fue revisado y aprobado por una organización independiente, el Grupo Copernicus dentro de la Junta de Revisión Institucional Occidental bajo el estudio no. 1186513. Se obtuvo el consentimiento informado de cada participante.

Nature Metabolism agradece a Robert Quinn y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Ashley Castellanos-Jankiewicz, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, pH de la muestra para tipos de dispositivos de muestreo intestinal. Los recuadros representan ±1 rango intercuartílico y la línea se extiende hasta la muestra más alejada de la mediana de la muestra con una extensión máxima de 1,5 rangos intercuartílicos desde la mediana. Todas las muestras se trazan como puntos individuales. (n = 274 dispositivos en total, Tipo de dispositivo 1 = 75, Tipo de dispositivo 2 = 70, Tipo de dispositivo 3 = 69, Tipo de dispositivo 4 = 60) ****: p < 0,0001 (rango con signo de Wilcoxon). b, Análisis de componentes principales (PCA) de alturas máximas normalizadas del conjunto de datos de metabolómica. Las muestras de control de calidad son contenidos intestinales combinados de muestras del tracto intestinal humano.

Las muestras y los metabolitos se organizan en el eje x y el eje y, respectivamente, por agrupación jerárquica. Cada muestra está etiquetada por número de sujeto y tipo de muestra (tipo de dispositivo o heces). El color representa la abundancia de metabolitos, y los valores mínimo y máximo se establecen individualmente para cada metabolito (fila).

Las muestras se organizan en el eje x por tipo de dispositivo y los metabolitos se organizan en el eje y según la agrupación jerárquica. El color representa la abundancia de metabolitos, y los valores mínimo y máximo para la escala de colores se establecen individualmente para cada metabolito (fila).

Datos de los dispositivos 1 + 2 (proximal) en comparación con los datos de los dispositivos 3+4 (distal). La significación se calculó utilizando un modelo lineal de efectos mixtos (LMM). La línea discontinua horizontal representa el umbral de significación de p < 0,05 (para conocer los valores de p exactos, consulte la Tabla complementaria 4). Los círculos indican metabolitos con diferencias no significativas después de la corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) o un coeficiente de tamaño del efecto < ± 0,2. Los diamantes indican metabolitos con diferencias significativas (p<0,05) después de la corrección FDR (n = 9317) y coeficiente de tamaño del efecto > ± 0,2. Solo se incluyeron en este análisis las características detectadas en >50 % de las muestras intestinales (n = 9317 características). El coeficiente de tamaño del efecto es la pendiente estimada por el LMM, con un coeficiente positivo (negativo) que representa un metabolito que es más alto (más bajo) en el intestino distal en comparación con el proximal en el intestino superior. Las líneas discontinuas verticales son ±0,20 veces el coeficiente del tamaño del efecto.

Las estadísticas de enriquecimiento químico fueron realizadas por ChemRICH. Los metabolitos detectados en >50 % de las muestras intestinales se incluyeron en este análisis (n = 1182 metabolitos). Estos resultados se visualizaron separando las clases por lipofilicidad química (logP) y el nivel de significación de la clase química de -log10 (valor p). Los círculos rojos indican que la clase química era más alta en el intestino superior distal en comparación con el proximal, y el azul indica que la clase química era más baja en el intestino superior distal en comparación con el proximal. Púrpura indica que el grupo químico tiene metabolitos que son significativamente más altos, así como metabolitos que son significativamente más bajos en el intestino distal en comparación con el proximal del intestino superior. El tamaño del círculo representa el tamaño de la clase química.

a, El número de metabolitos que diferían significativamente entre regiones intestinales (tipos de dispositivos) o entre comidas (puntos de tiempo de muestreo de cuatro dispositivos de cápsula) calculados para cada sujeto mediante análisis de varianza (Kruskal-Wallis). Para este análisis, solo se usaron los metabolitos detectados en >50 % de las muestras de cada sujeto (n = 1182 metabolitos). Se utilizó una p < 0,05 no corregida por FDR como umbral de significación. b, se realizó un análisis discriminante multivariable (PLS-DA) para identificar los metabolitos que eran más importantes para distinguir entre sujetos o entre regiones. Los 100 metabolitos más importantes para distinguir estos grupos se clasificaron por importancia variable en la puntuación de proyección (VIP) y se clasificaron por subclase química. Las subclases químicas con <3 metabolitos se informan como 'Otros'.

Para este análisis, solo se usaron los metabolitos detectados en >50 % de las muestras de cada sujeto (n = 1182 metabolitos). Se utilizó una p < 0,05 no corregida por FDR como valor de corte de significación. a, Metabolitos con abundancia significativamente diferente entre regiones intestinales para cada sujeto, agrupados por clase química y la proporción de cada clase química. b, Metabolitos con abundancia significativamente diferente entre los puntos de tiempo de muestreo, agrupados por clase química y la proporción de cada clase química.

Los metabolitos incluyen pigmentos biliares, ésteres de ácidos grasos de hidroxiácidos grasos (FAHFA y AAHFA), ácidos grasos de cadena corta, sulfolípidos (SL) y ácidos biliares secundarios. Se muestran los datos de todas las muestras de heces y las muestras están organizadas por tema. Se destacan los dos sujetos que consumieron antibióticos 1 y 5 meses antes de este estudio. La barra de color representa la abundancia de metabolitos (altura del pico) o la concentración (ng/ml) de ácidos biliares. Se utilizaron valores mínimos y máximos para establecer la escala de colores para cada metabolito (cada fila).

Los metabolitos son ésteres de ácidos grasos de hidroxiácidos grasos (FAHFA y AAHFA) y ácidos grasos detectados en >50 % de todas las muestras de dispositivos. Se muestran todas las muestras de dispositivos y están organizadas por tema. Dentro de las secciones superior (FAHFA) e inferior (ácidos grasos), los metabolitos se ordenan en función de la agrupación jerárquica. La barra de color representa la abundancia de metabolitos (altura del pico) o la concentración (ng/ml) de ácidos biliares. Se utilizaron valores mínimos y máximos para establecer la escala de colores para cada metabolito (cada fila).

Figs suplementarias. 1–3.

Tablas complementarias 1–9.

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Reimpresiones y permisos

Folz, J., Culver, RN, Morales, JM et al. Variación del metaboloma humano a lo largo del tracto intestinal superior. Nat Metab 5, 777–788 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00777-z

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Recibido: 24 de septiembre de 2022

Aceptado: 03 de marzo de 2023

Publicado: 10 mayo 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00777-z

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