Language
Biosíntesis de colesterol de novo en bacterias
HogarHogar > Noticias > Biosíntesis de colesterol de novo en bacterias
ÚLTIMAS NOTICIAS

Biosíntesis de colesterol de novo en bacterias

Apr 14, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2904 (2023) Citar este artículo

1598 Accesos

15 Altmetric

Detalles de métricas

Los eucariotas producen esteroles altamente modificados, incluido el colesterol, esencial para la fisiología eucariota. Aunque se conocen pocas especies bacterianas que produzcan esteroles, no se ha informado la producción de novo de colesterol u otros esteroles complejos en bacterias. Aquí, mostramos que la myxobacterium marina Enhygromyxa salina produce colesterol y proporcionamos evidencia de otras modificaciones posteriores. A través del análisis bioinformático identificamos una supuesta vía de biosíntesis de colesterol en E. salina en gran parte homóloga a la vía eucariótica. Sin embargo, la evidencia experimental indica que la desmetilación completa en C-4 ocurre a través de proteínas bacterianas únicas, distinguiendo la biosíntesis de colesterol bacteriano y eucariótico. Además, las proteínas de la cianobacteria Calothrix sp. NIES-4105 también es capaz de desmetilar completamente los esteroles en la posición C-4, lo que sugiere que la biosíntesis compleja de esteroles se puede encontrar en otros filos bacterianos. Nuestros resultados revelan una complejidad no apreciada en la producción de esteroles bacterianos que rivaliza con los eucariotas y resaltan la complicada relación evolutiva entre la biosíntesis de esteroles en los dominios bacteriano y eucariota.

Los esteroles son una clase de lípidos eucariotas ubicuos y esenciales importantes en una variedad de funciones fisiológicas, incluida la señalización celular, la homeostasis de la membrana y el tiempo de desarrollo1,2,3. La biosíntesis de esteroles eucarióticos se ha estudiado ampliamente y ha revelado vías biosintéticas complejas que incluyen un conjunto compartido de enzimas utilizadas para producir productos finales de esteroles similares que varían en el nivel de insaturaciones, desmetilaciones y alcalinizaciones4,5. El orden de las reacciones en estas rutas biosintéticas dictan la producción y acumulación de intermediarios de esteroles que desempeñan un papel regulador en la homeostasis de los lípidos6,7, la biosíntesis del producto corriente abajo8 y la respuesta al estrés9. Las modificaciones químicas requeridas para sintetizar colesterol en vertebrados, fitoesteroles en plantas y ergosterol en hongos son esenciales para las propiedades biofísicas de estos lípidos, afectando la localización y la dinámica de membrana en sus respectivos organismos10,11,12. Estos esteroles también sirven como punto de ramificación para la biosíntesis de metabolitos aguas abajo. Las reacciones de oxidación están involucradas en la conversión de esteroles en una amplia gama de compuestos que incluyen oxiesteroles, ácidos biliares, hormonas esteroides y brasinoesteroides que pueden funcionar como ligandos en varias vías de señalización13,14,15. Los eucariotas también conjugan esteroles con azúcares, proteínas y otros lípidos, lo que amplía aún más la función de los esteroles para incluir defensa celular, almacenamiento de energía, digestión y señalización16,17,18. En general, la complejidad de la biosíntesis de esteroles eucariotas refleja las diversas funciones y roles importantes que desempeñan estos lípidos en la fisiología eucariota.

Mientras que la biosíntesis y función de esteroles ha sido bien estudiada en organismos eucariotas, la síntesis y función de esteroles bacterianos está comparativamente poco explorada. Se sabe que varias bacterias, incluidos los metanótrofos aeróbicos, los planctomycetes y varias mixobacterias, producen esteroles de novo19. A diferencia de los eucariotas, estas bacterias producen en gran medida lanosterol, parkeol o cicloartenol, los productos de ciclación inicial de la oxidoescualeno ciclasa (OSC)20,21,22. Sin embargo, algunas bacterias realizan modificaciones químicas adicionales durante la síntesis de esteroles; las bacterias metanotróficas modifican los esteroles en distintas estructuras monometiladas específicas de Methylococcaceae19, los Planctomycetes que producen esteroles conjugan los esteroles en una macromolécula no identificada21, y varios Myxococcota23 producen intermediarios en la vía de biosíntesis del colesterol, incluido el zimosterol19,22,24. Además, los estudios filogenómicos han ampliado el número de posibles productores de esteroles bacterianos, identificando los genes necesarios tanto para la ciclación como para las modificaciones posteriores en filos en todo el dominio bacteriano25,26. Varias de estas bacterias albergan el potencial genético para producir los esteroles biosintéticamente complejos asociados con los eucariotas, incluido el colesterol; sin embargo, los análisis de lípidos aún tienen que confirmar la presencia de estos esteroles en las bacterias5.

La discrepancia entre la capacidad genómica para la producción de esteroles complejos y los esteroles observados en las bacterias nos llevó a realizar análisis de lípidos más completos de las bacterias productoras de esteroles. Estudios filogenéticos previos y nuestro propio análisis inicial de los genes de biosíntesis de esteroles de la mixobacteria marina Enhygromyxa salina sugirieron el potencial para la producción de esteroles biosintéticamente más complejos de lo que habíamos observado previamente. Presumimos que los análisis anteriores pueden haber subestimado el inventario de esteroles bacterianos debido a la biomasa limitada y/o técnicas de extracción de lípidos inadecuadas, lo que nos motivó a volver a analizar los esteroles en esta bacteria. De igual forma, el análisis de la cianobacteria Calothrix sp. El genoma NIES-4105 identificó un grupo de genes de biosíntesis de esteroles putativos, incluidos los necesarios para la biosíntesis de esteroles compleja, lo que nos llevó a ampliar nuestro análisis de esteroles a esta bacteria.

En este trabajo, revisamos el análisis de esteroles en E. salina, revelando una capacidad para sintetizar colesterol. Nuestro análisis bioinformático identificó homólogos para algunos, pero no todos, los pasos en la biosíntesis de colesterol eucariota, diferenciando la producción de colesterol bacteriano de la de los eucariotas. Además, demostramos que la desmetilación completa en C-4, un paso esencial en la biosíntesis de esteroles eucarióticos, ocurre a través de distintas proteínas bacterianas en E. salina y que los homólogos que se encuentran en la bacteria productora de esteroles filogenéticamente distinta, Calothrix, funcionan de manera similar. En conjunto, nuestros análisis de la biosíntesis de esteroles en estas bacterias filogenéticamente distintas sugieren una biología compleja que sustenta la producción de colesterol bacteriano y plantea preguntas más amplias sobre la biosíntesis, evolución y función de los esteroles.

Anteriormente demostramos la producción de zimosterol, un intermediario biosintético en la síntesis de colesterol, en extractos de lípidos de la myxobacterium Enhygromyxa salina19. Sin embargo, E. salina es una bacteria depredadora social que a menudo se cultiva en agar sólido que contiene levadura de células completas, lo que limita la cantidad de biomasa disponible para análisis extensos de lípidos27. Estas condiciones de cultivo también presentan una fuente potencial de contaminación con esteroles, ya que tanto el agar como la levadura suplementaria pueden contener esteroles. Para evaluar mejor el inventario de esteroles de este organismo, cultivamos E. salina en un medio líquido suplementado con células completas de Escherichia coli, que no produce esteroles de forma nativa. Estas condiciones de cultivo aumentaron 50 veces los lípidos extraíbles, lo que permitió análisis más extensos.

Primero extrajimos los lípidos libres de la biomasa de E. salina a través de una extracción Bligh-Dyer28. Estos análisis iniciales revelaron una variedad de esteroles, incluido el colesterol (Fig. 1a; Fig. 1 complementaria, Fig. 2 complementaria). También detectamos 4,4-dimetilcolesta-8,24-dienol, un intermedio que solo se desmetiló en C-14, lo que indica que E. salina realiza la desmetilación de C-14 antes que la desmetilación de C-4, como los hongos y los animales, y no después de eliminar el primer grupo metilo C-4, como las plantas5. También detectamos varios intermedios aguas abajo insaturados en C-24, incluidos zimosterol, colesta-7,24-dienol y desmosterol, pero ningún intermedio saturado en C-24. La acumulación de solo intermediarios insaturados C-24 sugiere que E. salina favorece la ruta de biosíntesis de colesterol de Bloch, donde la reducción de C-24 ocurre como el paso final en la biosíntesis de colesterol (Fig. 3 complementaria)29. La cuantificación del colesterol, así como de los intermedios desmosterol y zimosterol, reveló que los intermedios se encuentran en concentraciones similares o superiores al colesterol (Tabla complementaria 1). Finalmente, para controlar la posible contaminación, extrajimos tanto el medio de cultivo como el suplemento concentrado de E. coli sin biomasa bacteriana. Tanto los medios como los controles de extracción carecían de esteroles (Fig. 4 complementaria).

a Cromatograma de iones totales de esteroles libres de E. salina extraídos mediante el procedimiento de Bligh Dyer modificado. Los esteroles identificados incluían colesterol (VII) así como intermedios insaturados C-24 (I-VI). b Cromatograma de iones totales de esteroles unidos a éter y éster liberados de extractos de lípidos de E. salina por hidrólisis ácida. La hidrólisis liberó esteroles adicionales, incluido el 25-hidroxicolesterol (VIII) y otros hidroxiesteroles putativos (indicados con un asterisco). Todos los lípidos se derivatizaron a grupos trimetilsililo. Los espectros de masas de los esteroles identificados se muestran en la figura complementaria 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar E. salina en busca de posibles conjugados de esteroles, hidrolizamos tanto el extracto de lípidos totales (TLE) como la biomasa celular con base metanólica, que escinde los lípidos unidos a éster, o ácido metanólico, que escinde los lípidos unidos a éster y éter30. La hidrólisis de TLE con base metanólica no liberó esteroles adicionales, pero la hidrólisis con ácido metanólico liberó 25-hidroxicolesterol (25-OHC), así como oxiesteroles adicionales y otros posibles compuestos de esteroles modificados (Fig. 1b y Fig. 5 complementaria). La presencia de oxiesteroles después de la hidrólisis ácida de TLE, pero no después de la hidrólisis básica, sugiere que estas conjugaciones están mediadas por un enlace éter. Para caracterizar aún más la naturaleza química de los conjugados de esteroles, separamos los lípidos extraíbles por polaridad mediante cromatografía en columna Si-gel y fracciones hidrolizadas con ácido metanólico. Después de la hidrólisis, todos los esteroles, incluidos los hidroxiesteroles, solo estaban presentes en la fracción de alcohol, lo que sugiere que los esteroles conjugados tienen una polaridad similar a los esteroles libres. La hidrólisis directa de la biomasa celular con base metanólica o ácido no alteró el perfil de esteroles de E. salina con respecto al de los TLE hidrolizados. Para confirmar que estos esteroles adicionales no eran productos de degradación o autooxidación durante la hidrólisis, primero hidrolizamos con ácido los estándares de colesterol y desmosterol y no detectamos la producción de ningún hidroxiesterol. También agregamos hidroxitolueno butilado (BHT) a una extracción de hidrólisis ácida de E. salina y aún detectamos 25-hidroxicolesterol y los otros esteroles modificados potenciales observados en extracciones sin BHT (Figura complementaria 6).

La producción de colesterol por E. salina nos llevó a buscar una vía de biosíntesis putativa en su genoma. Realizamos una búsqueda BLASTp (<1 × e−30, 30% ID) contra proteínas de biosíntesis de esteroles de eucariotas y bacterias4,31. Elegimos un límite restrictivo para estas búsquedas de BLASTp para garantizar mejor que las proteínas identificadas estén probablemente involucradas en la biosíntesis de esteroles, ya que las proteínas en la vía de biosíntesis de colesterol pertenecen a grandes superfamilias que incluyen funciones fuera de la biosíntesis de esteroles5. Detectamos homólogos para casi todos los pasos en la ruta de biosíntesis de colesterol eucariótico en el genoma de E. salina (Fig. 2 y Tabla complementaria 2), aunque se necesita más caracterización bioquímica para demostrar que las proteínas identificadas no realizan reacciones adicionales en la célula. En particular, los genes de biosíntesis de esteroles no se localizan en grupos de genes, como se observa en otras bacterias productoras de esteroles32, sino que se encuentran en loci separados en todo el genoma (Fig. 7 complementaria). Usando esta ruta de biosíntesis de colesterol recién construida, buscamos homólogos en otras bacterias con capacidad genómica demostrada para la producción de esteroles (<1 × e-50, 30% ID). Identificamos 103 aislados bacterianos y 21 genomas ensamblados en metagenoma con escualeno monooxigenasa (SMO) y oxidoscualen ciclasa (OSC), los primeros pasos comprometidos en la biosíntesis de esteroles. De estos genomas y metagenomas bacterianos que contienen OSC y SMO, solo los otros aislados secuenciados de E. salina comparten los homólogos requeridos para la vía de biosíntesis del colesterol eucariótico, lo que indica que la producción de colesterol es probablemente una característica compartida de estas especies de E. salina (Datos complementarios 1) .

Los homólogos de las proteínas eucariotas canónicas para la biosíntesis de colesterol se identificaron mediante la búsqueda BLASTp (<1 × e-30, 30% ID; Tabla complementaria 2). Los esteroles identificados en la biomasa de E. salina están en negrita. E. salina no tiene homólogos de las enzimas eucariotas responsables de la desmetilación de C-4 y la hidroxilación de C-25. Las enzimas bacterianas para la desmetilación completa de esteroles C-4 y la hidroxilación C-25 no se han identificado y se indican con un signo de interrogación. El contexto genómico para los genes de E. salina identificados se muestra en la Fig. 7 complementaria. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Si bien E. salina comparte gran parte de su ruta de biosíntesis de colesterol con eucariotas, no tiene homólogos de las tres proteínas eucariotas responsables de la desmetilación de C-4. En cambio, E. salina tiene homólogos del par dioxigenasa-reductasa, SdmAB, que utilizan los metanótrofos aeróbicos para eliminar solo un grupo metilo en C-431. Para probar si los homólogos de E. salina SdmAB son suficientes para eliminar ambos grupos metilo en C-4, como se requiere para producir colesterol, empleamos un sistema de expresión heterólogo en una cepa de E. coli diseñada para producir en exceso el sustrato lanosterol (Fig. 3a )33. La expresión del homólogo de SdmA solo dio como resultado la producción de un intermedio de 4-metilaldehído. La expresión del homólogo de SdmB solo no generó ningún intermedio de desmetilación (Figuras complementarias 8 y 9). Curiosamente, la coexpresión de los homólogos de SdmAB no resultó en la eliminación de ningún grupo metilo en C-4 (Fig. 3b), lo que indica que estas dos proteínas no son suficientes para desmetilar completamente el lanosterol en la posición C-4 en E. salina y distinguir SdmAB en E. salina de los homólogos encontrados en metanótrofos aeróbicos.

a Cromatogramas de iones totales que muestran la producción de sustrato de lanosterol (I) en nuestro sistema de expresión heterólogo de E. coli. b Coexpresión de homólogos de SdmAB de E. salina, lo que da como resultado la producción de solo un intermedio de 4-metilaldehído (III). Estas dos enzimas son insuficientes para desmetilar en C-4, lo que las distingue de los homólogos de SdmAB en los metanótrofos aeróbicos. c Coexpresión de homólogos de SdmAC de E. salina, lo que da como resultado la eliminación de un solo grupo metilo en C-4. d Coexpresión de homólogos de SdmABC de E. salina, lo que da como resultado una desmetilación completa en C-4. Los lípidos se derivatizaron a grupos trimetilsililo. Los intermedios de desmetilación C-4 se confirmaron en un estudio anterior y se identificaron aquí en comparación con los espectros de masas publicados (32). Los espectros de masas de los esteroles identificados se muestran en la figura complementaria 9. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, buscamos determinar si la falta de desmetilación de C-4 por parte de los homólogos de E. salina estaba relacionada con SdmA o SdmB. Para hacerlo, aprovechamos los homólogos SdmA y SdmB de Methylococcus capsulatus, que juntos eliminan un solo grupo metilo en nuestro sistema de expresión, y los expresamos con su socio recíproco SdmA o SdmB de E. salina. La expresión de SdmA de E. salina con SdmB de M. capsulatus resultó en la eliminación de un solo grupo metilo en C-4, mientras que la expresión de SdmB de E. salina con SdmA de M. capsulatus no produjo desmetilación en C-4 (Suplementario Figura 10). Por lo tanto, proponemos que el homólogo de E. salina SdmA puede llevar a cabo las reacciones de oxigenación necesarias para desmetilar, pero el homólogo de E. salina SdmB es insuficiente para llevar a cabo las reacciones de descarboxilación y reducción necesarias para la desmetilación en la posición C-431. Estos resultados nos llevaron a reevaluar E. salina en busca de enzimas con potencial para llevar a cabo las reacciones de descarboxilación y reducción.

A través de una búsqueda BLASTp adicional del genoma de E. salina, identificamos otra reductasa de tipo SDR homóloga a SdmB, SdmC (1 × e−120, 51% de identidad), restringida al suborden Nannocystaceae de Myxococcota (Figura complementaria 11). La expresión de SdmC sola no dio como resultado la acumulación de ningún intermedio de desmetilación (Fig. 8 complementaria). Sin embargo, la coexpresión de SdmC con SdmA de E. salina resultó en la eliminación de un solo grupo metilo en C-4, lo que sugiere que SdmC es capaz de descarboxilar el grupo metilo oxidado y reducir la cetona restante en C-3 en un hidroxilo como se hizo. mostrado para M. capsulatus SdmB (Fig. 3c)31. Además, la coexpresión de SdmC con E. salina SdmAB da como resultado la eliminación de ambos grupos metilo en C-4 y la producción de intermediarios de desmetilación adicionales (Fig. 3d). Por lo tanto, la desmetilación completa en la posición C-4 en E. salina es distinta de la desmetilación bacteriana de C-4 en metanótrofos aeróbicos y eucariotas (Fig. 12 complementaria).

Si bien SdmC parece estar restringido a un suborden mixobacteriano específico, los homólogos de SdmAB se pueden encontrar en una variedad de genomas adquiridos de aislados y metagenomas (MAG) en todo el dominio. Esto incluye 31 bacterias en cinco filos diferentes (Datos complementarios 1). Estábamos interesados ​​en determinar si estos otros homólogos de SdmAB también eran suficientes para duplicar la desmetilación del lanosterol o si funcionaban de manera más similar a los homólogos de SdmAB en los metanótrofos aeróbicos y solo eliminaban un solo grupo metilo en C-4. En particular, la cianobacteria Calothrix sp. El genoma NIES-4105 alberga homólogos de SdmAB en un grupo de genes de 21 kb, que también contiene homólogos para la producción de oxidoscualeno, la ciclación, la desmetilación de C-14, la isomerización de C-8 y varias proteínas adicionales probablemente involucradas en la biosíntesis de esteroles (Fig. 4a y Tabla complementaria 2 ). Esta diversidad de genes de biosíntesis de esteroles en una cianobacteria no se había observado previamente, lo que sugiere que esta cepa de Calothrix podría producir esteroles complejos que están completamente desmetilados en la posición C-4. Para probar esto, primero expresamos heterólogamente el homólogo osc de Calothrix en una cepa de E. coli productora de oxidoscualeno que da como resultado la producción de lanosterol y confirma que la ciclasa de Calothrix es funcional (Fig. 13 complementaria). Luego expresamos los homólogos de Calothrix SdmAB para determinar si estas proteínas eran capaces de desmetilarse en C-4. La expresión del homólogo de SdmA solo dio como resultado la producción de un intermedio de 4-metilaldehído, mientras que la expresión del homólogo de SdmB solo dio como resultado la producción de lanosterona (Figuras complementarias 8 y 9). La coexpresión de Calothrix SdmAB fue suficiente para eliminar ambos grupos metilo en C-4, lo que demuestra una tercera vía bacteriana de desmetilación de C-4, distinta de E. salina, metanótrofos aeróbicos y eucariotas (Fig. 4b y Fig. 12 complementaria).

Los genes de biosíntesis de esteroles en Calothrix están localizados en un solo grupo de genes. Los genes identificados por nuestra búsqueda BLAST se indican en rojo y las etiquetas de texto en negrita. Cabe destacar varios otros genes anotados como genes de biosíntesis putativos que pueden ser responsables de llevar a cabo pasos adicionales en la biosíntesis de colesterol. b Cromatogramas de iones totales de la producción de sustrato de lanosterol en nuestro sistema de expresión heterólogo y coexpresión de homólogos de SdmAB de Calothrix que dan como resultado una desmetilación completa en C-4. Los lípidos se derivatizaron a grupos trimetilsililo. Los intermedios de desmetilación C-4 se confirmaron en un estudio anterior y se identificaron aquí en comparación con los espectros de masas publicados (32). Los espectros de masas de los esteroles identificados se muestran en la figura complementaria 9. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dada la evidencia genética y bioquímica de la producción de esteroles complejos en Calothrix, a continuación analizamos los esteroles producidos por esta bacteria. En nuestro análisis inicial, solo pudimos detectar esteroles después de la hidrólisis ácida de la biomasa celular (Figuras complementarias 1, 2 y 13). Estos esteroles incluían colesterol así como intermediarios C-24 insaturados y C-24 saturados. También identificamos 25-OHC en extractos hidrolizados de Calothrix, lo que sugiere además que los esteroles pueden conjugarse en Calothrix. Sin embargo, durante el curso de los análisis de lípidos, Calothrix cesó toda producción de esteroles. Para determinar si la pérdida de producción de esteroles en Calothrix se debió a una mutación genética en el grupo de genes biosintéticos de esteroles, secuenciamos el genoma de la cepa con pases en serie y lo comparamos con el genoma de referencia de Calothrix sp. NIES-4105. Detectamos 14 mutaciones en el genoma de la cepa pasada en serie en comparación con el genoma de referencia disponible en las bases de datos JGI IMG y NCBI; sin embargo, ninguna de estas mutaciones ocurrió en o aguas arriba del grupo de genes de biosíntesis de esteroles (Tabla complementaria 3). Si bien estos resultados hacen que nuestro análisis inicial de esteroles de Calothrix no sea concluyente, nuestros hallazgos sugieren que las cianobacterias son una fuente potencial de esteroles biosintéticamente complejos y un filo a tener en cuenta al investigar la biosíntesis de esteroles bacterianos.

En este estudio, demostramos que las bacterias albergan la capacidad de sintetizar colesterol de novo, mostrando una complejidad biosintética a menudo asociada con los eucariotas y sugiriendo la posibilidad de funciones fisiológicas matizadas para los esteroles en las bacterias. Nuestro análisis de E. salina identificó colesterol así como intermediarios en la ruta de biosíntesis del colesterol. La cuantificación de estos lípidos muestra que los intermediarios biosintéticos ocurren en concentraciones mayores o similares al colesterol mismo. Esto es distinto de la producción de colesterol en muchos eucariotas, donde los intermediarios pueden estar presentes pero a menudo en concentraciones de órdenes de magnitud más bajas que el colesterol u otros esteroles 'productos finales'34,35. Dadas las altas concentraciones de estos intermediarios en esta bacteria en relación con el colesterol, postulamos que los intermediarios del colesterol, como el desmosterol y el zimosterol, sirven como lípidos funcionales en sí mismos, aunque no está claro cuáles son esas funciones y si difieren del colesterol.

Nuestros análisis de Calothrix proporcionaron pruebas genómicas y bioquímicas de una capacidad para la producción de esteroles complejos; sin embargo, la producción de esteroles por parte de esta bacteria sigue siendo incierta. Históricamente, la biosíntesis de esteroles de novo en cianobacterias ha sido controvertida. Los primeros análisis de esteroles de las cianobacterias sugirieron una capacidad para la biosíntesis compleja de esteroles36. Sin embargo, hubo una falta de evidencia genómica de apoyo y, en varios casos, se demostró más tarde que la producción de esteroles era causada por la contaminación fúngica37,38. Nuestro trabajo que demuestra la funcionalidad de las proteínas de biosíntesis de esteroles de Calothrix, combinado con datos bioinformáticos que muestran una capacidad genética similar en otras cianobacterias, fomenta la investigación futura de las enzimas biosintéticas que se encuentran en estas bacterias y un mayor análisis de los esteroles que producen. Además, identificamos los genes necesarios para la biosíntesis de esteroles complejos, incluida la desmetilación de C-14 y C-4, en un conjunto diverso de bacterias, incluidas otras mixobacterias y cianobacterias, así como actinobacterias, acidobacterias y nitrospirea (Datos complementarios 1). En muchas de estas bacterias, aún no se ha analizado la producción de esteroles. Combinar un análisis de lípidos más sólido con un estudio más profundo de la biosíntesis de esteroles bacterianos nos permitiría comprender mejor la distribución, diversidad y complejidad de los esteroles en las bacterias.

La presencia de esteroles libres y conjugados en E. salina proporciona otro ejemplo de la complejidad biosintética de la producción de esteroles bacterianos. La conjugación de esteroles bacterianos no se limita a E. salina; otras bacterias conjugan esteroles, ya sea como producto de biosíntesis de novo21 o como modificación de esteroles adquiridos exógenamente39,40. Estos diferentes conjuntos de esteroles sugieren el potencial de un conjunto variado de funciones fisiológicas para los esteroles en las bacterias. Las conjugaciones con otras macromoléculas afectan las propiedades biofísicas de los esteroles41 y, en los sistemas eucariotas, estos lípidos modificados participan en funciones específicas, como el almacenamiento de lípidos y la defensa celular16,17. Si bien no se han identificado conjugados de esteroles intactos en bacterias productoras de esteroles, los conjugados de esteroles identificados en eucariotas y bacterias capaces de modificar esteroles exógenos pueden proporcionar una idea de los tipos de moléculas que podrían estar presentes en estas bacterias productoras de esteroles. Esto incluye esterilglucósidos, que se han identificado tanto en eucariotas35 como en bacterias modificadoras de esteroles39, y ésteres de esteroles, que según nuestro conocimiento solo se han encontrado en eucariotas16,42,43. Ampliar las técnicas de extracción utilizadas para analizar los lípidos de esteroles, identificar los conjugados de esteroles presentes y explorar las enzimas responsables de las modificaciones posteriores permitiría una mejor evaluación de la diversidad de esteroles conjugados en el dominio bacteriano y proporcionaría una base para una mayor exploración de la función de los esteroles.

La producción de colesterol por bacterias también apunta a una historia evolutiva complicada para la biosíntesis de esteroles en el dominio bacteriano. La biosíntesis de esteroles complejos es un proceso antiguo; Se cree que la oxidoescualeno ciclasa (OSC), responsable de la ciclación de esteroles, evolucionó alrededor del Gran Evento de Oxidación32 y los genes de biosíntesis de esteroles eucariotas actuales probablemente sean anteriores al último ancestro común eucariota5. Se ha teorizado que la biosíntesis de esteroles en bacterias es un producto de la transferencia horizontal de genes desde eucariotas, respaldada por su rareza y distribución desigual entre filos bacterianos32. Sin embargo, análisis filogenéticos y estructurales recientes de OSC y la desmetilasa C-14 (CYP51) sugieren un origen bacteriano para estas proteínas25,26,44. La supuesta ruta de biosíntesis de colesterol de E. salina que identificamos es en gran parte homóloga a la ruta eucariótica, lo que indica una historia evolutiva compartida para gran parte de la biosíntesis de colesterol entre esta mixobacteria y eucariotas, aunque nuestro análisis no proporciona información sobre la direccionalidad de la adquisición. Sin embargo, identificamos varias proteínas de biosíntesis de colesterol involucradas en la modificación de la desaturación, y estas proteínas no se han considerado en los análisis filogenéticos (Datos complementarios 1). Más análisis bioquímicos y filogenéticos de estas proteínas aguas abajo pueden resolver mejor las relaciones evolutivas que gobiernan la producción de esteroles en estos dos dominios.

La desmetilación bacteriana de C-4 continúa brindando un claro ejemplo de evolución independiente en la biosíntesis de esteroles. Identificamos proteínas responsables de la desmetilación completa de C-4 en E. salina y Calothrix distintas de las de los eucariotas, los metanótrofos aeróbicos y entre sí. En eucariotas, la desmetilación de C-4 es una reacción dependiente del oxígeno llevada a cabo por tres proteínas: una C-4 esterol metil oxidasa (ERG25/SMO), una C-4 descarboxilasa (ERG26/3β-HSD/D) y un 3-cetoesteroide. reductasa (ERG27/3-SR)45,46,47. Las tres proteínas están involucradas en un proceso iterativo que elimina secuencialmente ambos grupos metilo en la posición C-4, aunque se ha demostrado que las plantas utilizan dos proteínas SMO distintas para eliminar cada grupo metilo de forma no secuencial48. Anteriormente hemos demostrado que en los metanótrofos aeróbicos, la desmetilación de C-4 da como resultado la eliminación de un grupo metilo y se lleva a cabo mediante una oxigenasa de tipo Rieske, SdmA, y una reductasa dependiente de NADP, SdmB31. Aunque tanto E. salina como Calothrix albergaban homólogos de SdmA y SdmB, no estaba claro si estas dos proteínas serían suficientes para eliminar ambos grupos metilo en la posición C-4. Mostramos que los dos homólogos de Calothrix son suficientes para eliminar ambos grupos metilo en C-4, pero E. salina requiere una segunda reductasa para desmetilarse por completo. Estas enzimas no son homólogas a las proteínas eucariotas canónicas y establecen que la biosíntesis de colesterol en estas bacterias no es un simple caso de transferencia horizontal de genes. Más bien, representa un caso de evolución convergente en la biología de los esteroles que implica un papel fundamental de la desmetilación de los esteroles C-4 en la función de los esteroles en ambos dominios de la vida. De hecho, se ha demostrado que la desmetilación de C-4 es necesaria para el correcto funcionamiento en eucariotas, ya que las mutaciones de la desmetilasa de C-4 suelen ser letales45,49,50. Lo que no está claro es qué papel funcional desempeña la desmetilación de C-4 en las células bacterianas y si se requiere para la función adecuada de los esteroles, como se observa en los eucariotas. La caracterización bioquímica y estructural adicional de las diversas vías de desmetilación de C-4 bacterianas debería proporcionar información comparativa sobre la importancia funcional de esta modificación.

Finalmente, la biosíntesis de esteroles complejos en bacterias también es de interés por sus potenciales aplicaciones industriales y biomédicas. Se ha sugerido que la producción de lípidos triterpenoides cíclicos, incluidos los hopanoides en bacterias y esteroles en hongos, aumenta la resiliencia de estos microbios frente a los diferentes tipos de estrés que se encuentran en las condiciones de cultivo industrial, incluido el estrés por temperatura y etanol51,52. Una mejor comprensión de los genes de biosíntesis de esteroles y el desarrollo de sistemas de expresión de esteroles brinda más oportunidades para mejorar la ingeniería de microbios para aplicaciones industriales. Además, varias mixobacterias, incluidos otros aislados de E. salina, producen metabolitos secundarios derivados de esteroides con propiedades antimicrobianas demostradas53,54,55. Sin embargo, las mixobacterias, particularmente las de ambientes marinos como E. salina, a menudo son difíciles de cultivar, genéticamente intratables y producen metabolitos secundarios en bajas concentraciones56. Esto ha llevado a un mayor interés en comprender las vías de biosíntesis de productos naturales en estos organismos y en el desarrollo de sistemas heterólogos para producir estos compuestos57. La exploración de la biosíntesis de esteroides en mixobacterias puede revelar nuevas enzimas de biosíntesis al tiempo que proporciona un marco para producir mejor estos compuestos. Además, el sistema de expresión heterólogo modular que usamos aquí para explorar la desmetilación de C-4 presenta una oportunidad para producir en exceso productos intermedios biosintéticos en la biosíntesis de colesterol, muchos de los cuales no están disponibles comercialmente o son prohibitivamente costosos. Estos intermedios biosintéticos han demostrado ser útiles para estudiar la biosíntesis, regulación y función del colesterol en eucariotas y, en algunos casos, tienen implicaciones clínicas58. Continuar con la caracterización de la biosíntesis del colesterol bacteriano utilizando estos sistemas heterólogos creará herramientas para estudiar mejor los esteroles en otros organismos, al mismo tiempo que proporcionará información sobre preguntas más amplias sobre la biología y la evolución de los esteroles.

Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en el Apéndice SI, Tabla S4. E. salina DSM 15201 se cultivó en 20 ml de medio Seawater Salts (SWS), pH 7 en matraces Erlenmeyer, suplementado con E. coli de células enteras concentradas y esterilizadas en autoclave, a 30 °C con agitación a 225 rpm (Thermo Scientific, MaxQ8000 ), durante 14 días27. Para preparar el concentrado de E. coli de células enteras, se cultivó E. coli DH10B hasta una DO600 entre 1,0 y 1,5 en 500 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer. Esta E. coli se sedimentó, se resuspendió en 50 ml de SWS y se sometió a autoclave. En el transcurso de 14 días, se alimentaron 5 ml de esta suspensión concentrada de E. coli al cultivo de E. salina a medida que se aclaraba el medio59. Calothrix sp. NEIS-4105 se cultivó en 20 ml de medio líquido BG-11, pH 760 en un matraz Erlenmeyer a 25 °C durante 60 días con ciclos de 10 h de luz y 14 h de oscuridad. Las cepas de expresión heteróloga de E. coli se cultivaron en 25 ml de medio TYGPN a 30 °C o 37 °C, se agitaron a 225 rpm y se complementaron, si era necesario, con gentamicina (15 μg/mL), kanamicina (30 μg/mL), carbenicilina (100 μg/mL) y/o cloranfenicol (20 μg/mL).

Los esteroles no unidos se extrajeron de sedimentos celulares liofilizados mediante una extracción Bligh-Dyer modificada28. Los sedimentos se sometieron a ultrasonidos durante 1 h en metanol:diclorometano (DCM):agua 10:5:4 (vol:vol:vol). A continuación, los lípidos se separaron en fases utilizando dos veces el volumen 1:1 (vol:vol) de DCM:agua. La fase orgánica se transfirió y se evaporó bajo gas N2 produciendo extractos de lípidos totales (TLE). Cuando correspondía, el TLE se fraccionó por polaridad usando cromatografía de Si a través del siguiente esquema de columna: 1,5 volúmenes de columna de hexanos, 2 volúmenes de columna de 8:2 (vol:vol) de hexano: DCM, 2 volúmenes de columna de DCM, 2 volúmenes de columna 1: 1 (vol: vol) DCM: acetato de etilo, 2 volúmenes de columna de acetato de etilo que producen una fracción de alquinos, no polares, cetonas, alcoholes y polares, respectivamente61.

Los esteroles unidos se analizaron hidrolizando extractos de lípidos, fracciones de cromatografía de Si-gel o sedimentos de células liofilizadas en HCl 1 N o KOH en metanol y se calentaron a 75 °C durante 3 h. Las reacciones se neutralizaron usando KOH o HCl respectivamente y las fases se separaron usando el doble del volumen de 1:1 (vol:vol) de DCM:agua. La fase orgánica se transfirió y evaporó bajo gas N2. Cuando correspondía, se añadió hidroxitolueno butilado (BHT) a las muestras de hidrólisis ácida a una concentración final del 0,01 % (p: vol) de BHT: MeOH62.

Las concentraciones de colesterol, desmosterol, zimosterol y 25-hidroxicolesterol (25OCH) en las muestras se cuantificaron mediante una curva estándar que oscilaba entre 10 ng y 100 ng. El contenido de esteroles se calculó usando la curva estándar y se normalizó al peso celular seco de cada muestra. Además, se determinó que el límite de detección de esteroles en nuestro espectrómetro de masas estaba entre 1 y 5 ng mediante la dilución de una mezcla estándar de esteroles.

Todos los lípidos se derivatizaron a trimetilsilil éteres utilizando bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida:piridina 1:1 (vol:vol) y calentando a 70 °C durante 1 h antes del análisis en un GC Agilent 7890B Series. Los lípidos se separaron en una columna Agilent DB17HT de 60 m (60 mx 0,25 mm id x 0,1 μm de espesor de película) con helio como gas portador a un flujo constante de 1,1 ml/min y se programó de la siguiente manera: 100 °C durante 2 min; luego 8 °C/min hasta 250 °C y se mantuvo durante 10 min; luego 3 °C/min hasta 330 °C y se mantuvo durante 17 min. En total, se inyectaron 2 μL de cada muestra en modo splitless a 250 °C. El GC se acopló a un MSD serie 5977 A con la fuente de iones a 230 °C y se operó a 70 eV en modo EI escaneando desde 50-850 Da en 0,5 s. Los lípidos se analizaron mediante Agilent MassHunter Qualitative Analysis (B.06.00) y se identificaron en función del tiempo de retención y los espectros en comparación con estándares de laboratorio previamente confirmados, espectros publicados31,63,64 y espectros depositados en la American Oil Chemists' Society (AOCS). Library (http://lipidlibrary.aocs.org/index.cfm) o las bases de datos del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).

Los plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este estudio se describen en la Tabla complementaria 5 y la Tabla complementaria 6. Los oligonucleótidos se compraron en Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). El ADN genómico de E. salina se aisló utilizando el kit de purificación de ADN genómico GeneJET (Thermo Scientific). ADN genómico de Calothrix sp. NEIS-4105 se aisló utilizando una extracción con fenol-cloroformo65, donde se añadió un volumen de 25:24:1 de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (vol:vol:vol) a la biomasa, se centrifugó y se eliminó la capa acuosa. Esto se repitió dos veces antes de precipitar el ADN genómico usando el doble del volumen de etanol al 70 %. El ADN del plásmido se aisló utilizando el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). Los fragmentos de ADN utilizados durante la clonación se aislaron utilizando el kit de extracción en gel GeneJET (Thermo Scientific). El ADN fue secuenciado por ELIM Biopharm (Hayward, CA).

Los plásmidos se construyeron mediante clonación independiente de secuencia y ligación (SLIC)66. Brevemente, se crearon salientes complementarios en insertos de producto de PCR purificados en gel y un vector linealizado con enzima de restricción mediante incubación con ADN polimerasa T4 (EMD Milipore) en ausencia de nucleótidos. Esto fue seguido por una reacción de recocido y transformación sin ligadura. Las cepas de E. coli se transformaron por electroporación utilizando un electroporador MicroPulser (BioRad) según lo recomendado por el fabricante.

Los genes de biosíntesis de esteroles se sobreexpresaron en E. coli a partir de plásmidos compatibles con un promotor lac inducible por IPTG o araBAD inducible por arabinosa33. Las cepas de expresión heterólogas se construyeron como se describe en la Tabla complementaria 7. Los genes de interés se expresaron a partir del plásmido inducible por IPTG pSRKGm-lacUV5-rbs5 y/o el plásmido inducible por arabinosa pBAD1031K. Las cepas de E. coli se cultivaron a 37 °C, en 20 ml de medio TYGPN suplementado con antibióticos (según sea necesario) hasta la fase exponencial media cuando se indujo la expresión con IPTG 500 μM y arabinosa al 0,2 % (peso: volumen) durante 30–40 h a 30 °C con agitación a 225 rpm, antes de la recolección de células.

Para identificar genes de biosíntesis de esteroles en E. salina y Calothrix, realizamos una búsqueda BLASTp67. Para ser considerado un gen de biosíntesis de esteroles putativo, establecimos un límite de valor e de 1 xe−30 y un límite de identidad porcentual de 30. Los resultados de la búsqueda BLASTp se enumeran en la Tabla complementaria 2. Para identificar otras bacterias que albergaban los genes de biosíntesis de esteroles identificamos en E. salina y Calothrix, primero realizamos una búsqueda BLASTp de bacterias en las bases de datos genómicas en el portal JGI IMG (https://img.jgi.doe.gov/) para OSC (<1 × e −50, 30% DI). De este subconjunto de bacterias, realizamos más búsquedas BLASTp (<1 × e−50, 30% ID) usando proteínas identificadas de E. salina y Calothrix68,69. Se generó un árbol de unión de vecinos de homólogos de SdmBC alineando secuencias de proteínas usando MUSCLE en MEGA (11.0.10). A continuación, se generó el árbol filogenético utilizando el modelo gamma, cuatro categorías de tasa gamma y 500 réplicas de arranque.

La preparación de la biblioteca (Illumina DNA Prep Kit; San Diego, CA) y la secuenciación del genoma completo se realizaron en SeqCenter (SeqCenter; Pittsburgh, PA) y se secuenciaron en un Illumina NextSeq 2000, produciendo lecturas de 2 x 151 pb. Bclconvert (v3.9.3) se utilizó para demultiplexar, controlar la calidad y recortar. Para identificar mutaciones en la cepa con pases en serie, se realizó una llamada de variante utilizando breseq (v0.35.4)70.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados en este estudio se proporcionan en los archivos de Información complementaria y Datos de origen. Los ID de genes JGI IMG (https://img.jgi.doe.gov/) para genes de biosíntesis de esteroles en E. salina y Calothrix se proporcionan en la Tabla complementaria 2. El archivo de datos de origen incluye los datos de cromatograma de iones totales sin procesar utilizados para generar texto principal y figuras complementarias, así como los datos de espectrometría de masas sin procesar utilizados para generar datos de espectros complementarios. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Swan, TM & Watson, K. Tolerancia al estrés en un auxótrofo de esterol de levadura: papel del ergosterol, proteínas de choque térmico y trehalosa. FEMS Microbiol. Letón. 169, 191–197 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tabas, I. El colesterol en la salud y la enfermedad. J. Clin. Invertir. 110, 583–590 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hartmann, M.-A. Los esteroles vegetales y el entorno de la membrana. Tendencias Plant Sci. 3, 170–175 (1998).

Artículo Google Académico

Nes, WD Biosíntesis de colesterol y otros esteroles. química Rev. 111, 6423–6451 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desmond, E. & Gribaldo, S. Filogenómica de la síntesis de esteroles: información sobre el origen, la evolución y la diversidad de una característica eucariota clave. Genoma Biol. Evol. 1, 364–381 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Spann, Nueva Jersey y col. La acumulación regulada de desmosterol integra el metabolismo de los lípidos de los macrófagos y las respuestas inflamatorias. Celda 151, 138–152 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, C. et al. Intermedios de esteroles de la vía biosintética del colesterol como ligandos del receptor X hepático *. J. Biol. química 281, 27816–27826 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ & Brown, AJ DHCR7: Un interruptor enzimático vital entre la producción de colesterol y vitamina D. prog. Res. de lípidos 64, 138–151 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Araldi, E. et al. El lanosterol modula las respuestas inmunitarias innatas mediadas por TLR4 en los macrófagos. Representante celular 19, 2743–2755 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Róg, T., Vattulainen, I., Jansen, M., Ikonen, E. & Karttunen, M. Comparación del colesterol y sus precursores directos a lo largo de la vía biosintética: Efectos del colesterol, desmosterol y 7-dehidrocolesterol sobre los lípidos saturados e insaturados bicapas. J. Chem. física 129, 154508 (2008).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Czub, J. & Baginski, M. Estudio comparativo de dinámica molecular de membranas lipídicas que contienen colesterol y ergosterol. Biografía. J. 90, 2368–2382 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hąc-Wydro, K., Wydro, P., Jagoda, A. & Kapusta, J. El estudio sobre la interacción entre fitoesteroles y fosfolípidos en membranas modelo. química física Lípidos 150, 22–34 (2007).

Artículo PubMed Google Académico

Nedelcu, D., Liu, J., Xu, Y., Jao, C. y Salic, A. Unión de oxisterol al dominio extracelular de Smoothened en la señalización de Hedgehog. Nat. química Biol. 9, 557–564 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J. & Schoonjans, K. Orientación de la señalización de ácidos biliares para enfermedades metabólicas. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 7, 678–693 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Clouse, SD, Langford, M. & McMorris, TC Un mutante insensible a los brasinoesteroides en arabidopsis thaliana exhibe múltiples defectos en el crecimiento y desarrollo. Fisiol vegetal. 111, 671–678 (1996).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bailey, RB & Parks, LW Ésteres de esteroles de levadura y su relación con el crecimiento de la levadura. J. Bacteriol. 124, 606–612 (1975).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferrer, A., Altabella, T., Arró, M. & Boronat, A. Emerging roles for conjugated sterols in plants. Prog. Lipid Res. 67, 27–37 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C. & Maldonado-Valderrama, J. Sales biliares en la digestión y transporte de lípidos. Adv. Ciencia de la interfaz coloidal. 274, 102045 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wei, JH, Yin, X. & Welander, Síntesis de esteroles PV en bacterias diversas. Frente. Microbiol. 7, https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00990 (2016).

Bouvier, P., Rohmer, M., Benveniste, P. & Ourisson, G. Delta8(14)-esteroides en la bacteria Methylococcus capsulatus. Bioquímica J. 159, 267–271 (1976).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pearson, A., Budin, M. & Brocks, JJ Evidencia filogenética y bioquímica de la síntesis de esteroles en la bacteria Gemmata obscuriglobus. proc. Academia Nacional. ciencia USA 100, 15352–15357 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bode, HB et al. Biosíntesis de esteroides en procariotas: identificación de esteroides mixobacterianos y clonación de la primera 2,3(S)-oxidoescualeno ciclasa bacteriana de la myxobacterium Stigmatella aurantiaca. mol. Microbiol. 47, 471–481 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Waite, DW et al. Propuesta para reclasificar las clases de proteobacterias Deltaproteobacteria y Oligoflexia, y el phylum Thermodesulfobacteria en cuatro phyla que reflejan las principales capacidades funcionales. En t. Sistema J. Evolución Microbiol. 70, 5972–6016 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Kohl, W., Gloe, A. y Reichenbach, H. Esteroides de Myxobacterium Nannocystis exedens. Microbiología 129, 1629–1635 (1983).

Artículo CAS Google Académico

Hoshino, Y. & Gaucher, EA Evolución de la biosíntesis de esteroides bacterianos y su impacto en la eucariogénesis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 118, e2101276118 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Santana-Molina, C., Rivas-Marin, E., Rojas, AM & Devos, DP Origen y evolución de la síntesis de triterpenos policíclicos. mol. Biol. Evol. 37, 1925–1941 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iizuka, T. et al. Enhygromyxa salina gen. nov., sp. nov., una Myxobacterium Ligeramente Halófila Aislada de las Áreas Costeras de Japón. sist. aplicación Microbiol. 26, 189–196 (2003).

Artículo PubMed Google Académico

Bligh, EG & Dyer, WJ Un método rápido de extracción y purificación de lípidos totales. Poder. J. Bioquímica. Fisiol. 37, 911–917 (1959).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bloch, K. La síntesis biológica del colesterol. Ciencia 150, 19–28 (1965).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Breinhölder, P., Mosca, L. & Lindner, W. Concepto de análisis secuencial de fitoesteroles libres y conjugados en diferentes matrices vegetales. J. Chromatogr. B 777, 67–82 (2002).

Artículo Google Académico

Lee, AK et al. Las enzimas de desmetilación de esteroles C-4 distinguen la síntesis de esteroles bacterianos y eucarióticos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, 5884–5889 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gold, DA, Caron, A., Fournier, GP & Summons, RE Biosíntesis de esteroles paleoproterozoicos y aumento del oxígeno. Naturaleza 543, 420–423 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Banta, AB, Wei, JH, Gill, CCC, Giner, J.-L. & Welander, PV Síntesis de triterpenoles de arborano por una oxidoescualeno ciclasa bacteriana. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 114, 245–250 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Maczek, J., Junne, S., Nowak, P. y Goetz, P. Análisis de flujo metabólico de la vía de los esteroles en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Bioproceso Biosist. Ing. 29, 241–252 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ačimovič, J. & Rozman, D. Triterpenos esteroideos de la síntesis de colesterol. Moléculas 18, 4002–4017 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Paoletti, C., Pushparaj, B., Florenzano, G., Capella, P. & Lercker, G. La materia insaponificable de los lípidos de algas verdes y azul-verdes como factor de diferenciación bioquímica de sus biomasas: II. Fracciones de alcoholes terpénicos y esteroles. Lípidos 11, 266–271 (1976).

Artículo CAS Google Académico

Summons, RE, Bradley, AS, Jahnke, LL & Waldbauer, JR Esteroides, triterpenoides y oxígeno molecular. Filosofía Trans. R. Soc. B: Biol. ciencia 361, 951–968 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Volkman, JK La fisiología de las microalgas (eds. Borowitzka, MA, Beardall, J. & Raven, JA) 485–505 (Springer International Publishing, 2016).

Hirai, Y. et al. Glucósidos de colesterilo únicos en Helicobacter pylori: composición y análisis estructural. J. Bacteriol. 177, 5327–5333 (1995).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crowley, JT et al. Intercambio de lípidos entre borrelia burgdorferi y células huésped. Patog de PLoS. 9, e1003109 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grunwald, C. Efectos de los esteroles libres, éster de esterilo y glucósido de esterilo en la permeabilidad de la membrana 1. Plant Physiol. 48, 653–655 (1971).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Banaś, A. et al. La síntesis de ésteres de esteroles celulares en las plantas se realiza mediante una enzima (fosfolípido:esterol aciltransferasa) diferente de las acil-coa:esterol aciltransferasas de levaduras y mamíferos*. J. Biol. química 280, 34626–34634 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Buhman , KF , Accad , M. & Farese , RV Mammalian acil-CoA:colesterol aciltransferasas . bioquimica Biografía. Acta (BBA) - Mol. Biol celular. Lípidos 1529, 142–154.

CAS Google Académico

Cordero, DC et al. En cuanto a la evolución de P450: los análisis estructurales respaldan el origen bacteriano de las esterol 14α-desmetilasas. mol. Biol. Evol. 38, 952–967 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bardo, M. et al. Clonación y caracterización de ERG25, el gen de Saccharomyces cerevisiae que codifica la C-4 esterol metil oxidasa. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 93, 186–190 (1996).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gachotte, D., Barbuch, R., Gaylor, J., Nickel, E. & Bard, M. Caracterización del gen ERG26 de Saccharomyces cerevisiae que codifica la C-3 esterol deshidrogenasa (C-4 descarboxilasa) involucrada en la biosíntesis de esteroles. proc. Academia Nacional. ciencia USA 95, 13794–13799 (1998).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gachotte, D. et al. Caracterización del gen ERG27 de Saccharomyces cerevisiae que codifica la 3-ceto reductasa involucrada en la desmetilación de C-4 esteroles. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 96, 12655–12660 (1999).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rahier, A., Darnet, S., Bouvier, F. & Camara, B. Síntesis de isoprenoides en plantas y microorganismos: nuevos conceptos y enfoques experimentales (eds. Bach, TJ & Rohmer, M.) p. 367–380 (Springer, 2013).

Xu, F. et al. Funciones duales del colesterol en células de mamíferos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 102, 14551–14556 (2005).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, X. et al. Las oxidasas de esterol metilo afectan el desarrollo del embrión a través de mecanismos asociados con auxina. Fisiol vegetal. 171, 468–482 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brenac, L., Baidoo, EEK, Keasling, JD & Budin, I. Funciones funcionales distintas para la composición hopanoide en la tolerancia química de Zymomonas mobilis. mol. Microbiol. 112, 1564–1575 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Caspeta, L. et al. La composición alterada de esteroles hace que la levadura sea termotolerante. Ciencia 346, 75–78 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Felder, S. et al. Salimixinas y enhigrolidos: antibióticos, metabolitos relacionados con esponjas de la myxobacterium marina obligada enhygromyxa salina. ChemBioChem 14, 1363–1371 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gawas, D., García, R., Huch, V. & Müller, R. Un esteroide C28 dihidroxilado altamente conjugado de una mixobacteria. J.Nat. Pinchar. 74, 1281–1283 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Amiri Moghaddam, J. et al. El análisis del genoma y el metaboloma de las mixobacterias marinas revela un alto potencial para la biosíntesis de nuevos metabolitos especializados. ciencia Rep. 8, 16600 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garcia, R., La Clair, JJ & Müller, R. Direcciones futuras del descubrimiento de productos naturales mixobacterianos marinos inferidos de la metagenómica. Mar. Drogas 16, 303 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wenzel, SC y col. Expresión heteróloga de una línea de ensamblaje de productos naturales mixobacterianos en pseudomonas a través de la recombinación Red/ET. química Biol. 12, 349–356 (2005).

Artículo MathSciNet CAS PubMed Google Académico

Byskov, AG, Andersen, CY, Leonardsen, L. & Baltsen, M. Esteroles activadores de la meiosis (MAS) y fertilidad en mamíferos y hombres. Exp. J. Zool. 285, 237–242 (1999).

3.0.CO;2-S" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-010X%2819991015%29285%3A3%3C237%3A%3AAID-JEZ6%3E3.0.CO%3B2-S" aria-label="Article reference 58" data-doi="10.1002/(SICI)1097-010X(19991015)285:33.0.CO;2-S">Artículo CAS PubMed Google Académico

Moghaddam, JA et al. Diferentes estrategias de osmoadaptación en las mixobacterias marinas estrechamente relacionadas Enhygromyxa salina SWB007 y Plesiocystis pacifica SIR-1. Microbiología 162, 651–661 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Olvera-Ramírez, R. et al. Evaluación del crecimiento y caracterización de bioproductos de Calothrix sp. Biorrecursos. Tecnología 72, 121–124 (2000).

Artículo Google Académico

Convocatoria, RE et al. Biomarcadores lipídicos en ooides de diferentes lugares y edades: evidencia de una flora bacteriana común. Geobiología 11, 420–436 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kehelpannala, C. et al. Una comparación completa de cuatro métodos para extraer lípidos de tejidos de Arabidopsis. Métodos de plantas 16, 155 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gerst, N., Ruan, B., Pang, J., Wilson, WK y Schroepfer, GJ Una mirada actualizada al análisis de esteroles C27 insaturados mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas. J. Lipid Res. 38, 1685-1701 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mack, YSI, Dehari, M., Morooka, N. & Nagata, S. Identificación y caracterización de la 24-dehidrocolesterol reductasa (DHCR24) en el grillo de dos manchas, Gryllus bimaculatus. Insectos 12, 782 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sambrook, J. & Russell, DW Purificación de ácidos nucleicos por extracción con fenol:cloroformo. Harb de primavera fría. Protocolo 2006, pdb.prot4455 (2006).

Artículo Google Académico

Li, MZ & Elledge, SJ SLIC: un método para la clonación independiente de secuencias y ligaduras. Métodos Mol. Biol. 852, 51–59 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Altschul, SF et al. Gapped BLAST y PSI-BLAST: una nueva generación de programas de búsqueda de bases de datos de proteínas. Ácidos Nucleicos Res. 25, 3389-3402 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, I.-MA et al. Apoyar la anotación de la comunidad y la colaboración de los usuarios en el sistema de genomas microbianos integrados (IMG). BMC Genomics 17, 307 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Markowitz, VM et al. Versión IMG 4 del sistema integrado de análisis comparativo de genomas microbianos. Ácidos Nucleicos Res. 42, D560–D567 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Deatherage, DE & Barrick, JE Identificación de mutaciones en microbios desarrollados en laboratorio a partir de datos de secuenciación de próxima generación usando breseq. Métodos Mol. Biol. 1151, 165–188 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Damos las gracias a los miembros del laboratorio Welander útil para los debates. La financiación de este estudio fue proporcionada por el Premio de la Fundación Nacional de Ciencias 1919153 (a PVW).

Departamento de Ciencias del Sistema Terrestre, Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Alysha K. Lee, Jeremy H. Wei y Paula V. Welander

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Investigación diseñada por AKL, JHW ​​y PVW; AKL y JHW realizaron investigaciones; AKL, JHW ​​y PVW analizaron datos; y AKL, JHW ​​y PVW escribieron el artículo.

Correspondencia a Paula V. Welander.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Miguel C. Santoscoy y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Lee, AK, Wei, JH & Welander, PV Biosíntesis de colesterol de novo en bacterias. Nat Comun 14, 2904 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

Descargar cita

Recibido: 20 de octubre de 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.