La microbiota cecal de pollo reduce la acumulación de grasa abdominal al regular el metabolismo de las grasas

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 28 (2023) Citar este artículo

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La microbiota cecal juega un papel esencial en la salud de los pollos. Sin embargo, su contribución al metabolismo de las grasas, particularmente en la deposición de grasa abdominal, que es un problema grave en la industria avícola, aún no está clara. Aquí, se seleccionaron pollos de 1, 4 y 12 meses de edad con una deposición de grasa abdominal significativamente más alta y más baja (p < 0,05) para dilucidar el metabolismo de las grasas. Una expresión de ARNm significativamente (p < 0,05) más alta de genes de anabolismo de grasa (ACSL1, FADS1, CYP2C45, ACC y FAS), una expresión de ARNm significativamente (p < 0,05) más baja de genes de catabolismo de grasa (CPT-1 y PPARα) y El gen de transporte APOAI en hígado/grasa abdominal de pollos con alta deposición de grasa abdominal indicó que un metabolismo de grasa desequilibrado conduce a una deposición excesiva de grasa abdominal. Parabacteroides, Parasutterella, Oscillibacter y Anaerofustis se encontraron significativamente (p < 0,05) más altos en pollos con alta deposición de grasa abdominal, mientras que Sphaerochaeta fue más alto en pollos con baja deposición de grasa abdominal. Además, el análisis de correlación de Spearman indicó que la abundancia relativa de Parabacteroides cecal, Parasutterella, Oscillibacter y Anaerofustis se correlacionó positivamente con la deposición de grasa abdominal, mientras que Sphaerochaeta cecal se correlacionó negativamente con la deposición de grasa. Curiosamente, la transferencia de microbiota fecal de pollos adultos con baja deposición de grasa abdominal a pollitos de un día de edad disminuyó significativamente (p < 0,05) los genes de Parabacteroides y anabolismo de grasas, mientras que aumentó notablemente los genes de Sphaerochaeta (p < 0,05) y catabolismo de grasas (p < 0,05). ). Nuestros hallazgos podrían ayudar a evaluar el mecanismo potencial de la microbiota cecal que regula la deposición de grasa en la producción de pollos.

En la industria avícola, la selección artificial de pollos con fines comerciales a través de la tecnología de reproducción genética y una dieta más energética mejoró sin precedentes la tasa de crecimiento y la conversión alimenticia de los pollos de engorde1. Sin embargo, los pollos de engorde de rápido crecimiento a menudo van acompañados de un depósito excesivo de grasa abdominal2, que es un rasgo desfavorable tanto para los consumidores como para los productores, y más del 85 % de la grasa abdominal es inútil para el cuerpo porque se considera el desperdicio de energía dietética3. Un informe reciente indicó que los pollos de engorde producen ≈3 millones de toneladas de grasa abdominal en todo el mundo anualmente, lo que resulta en una pérdida económica de más de USD 2700 millones en la industria avícola4, lo que genera un obstáculo clave para una ganadería rentable5. Si bien es un componente energético apreciable, debe ser eliminado durante la evisceración y se considera un desecho en la producción de carne de pollo6. La deposición de grasa abdominal disminuye la utilización del alimento, reduce el desempeño reproductivo de las gallinas ponedoras, afecta negativamente el proceso de sacrificio y causa contaminación ambiental2,7,8. También aumenta el contenido de grasa en la carne de pollo, lo que aumenta el riesgo de enfermedades cardiovasculares humanas9. Los investigadores han descubierto que, biológicamente, los adipocitos abdominales son células más activas que exhiben una tasa de heredabilidad más alta (0,82) que el peso corporal, los senos y los músculos de las piernas5, lo que da como resultado la acumulación de grasa. También se informa que el peso de la grasa abdominal y el peso corporal tenían una fuerte correlación positiva, lo que dificulta la selección genética contra los rasgos de gordura en los pollos4. La deposición excesiva de grasa se ha convertido en un rompecabezas y también en una preocupación emergente en las últimas décadas. Por lo tanto, comprender el mecanismo que conduce a la deposición excesiva de grasa se ha convertido en una cuestión importante.

El intestino del huésped alberga ~80 % de los microorganismos simbiontes, de los cuales el 99 % son bacterias, denominada microbiota intestinal10,11,12,13. Se ha establecido que la microbiota intestinal podría desempeñar un papel regulador importante en el depósito de grasa y la obesidad4,14. La evidencia reveló que la colonización de la microbiota obesa promovió la deposición de grasa en ratones15. Por ejemplo, una mayor abundancia de Methanobrevibacter y Faecalibacterium, mientras que una menor abundancia de Akkermansia aumenta la deposición de grasa4,6. Otros estudios indicaron que la microbiota intestinal influye y modula el metabolismo de las grasas, y contribuye de manera importante a la utilización de nutrientes, generando energía aprovechable adicional y dando como resultado la deposición de grasa abdominal6,16. Por ejemplo, Enterococcus faecium aumenta la secreción de ácido graso sintasa (FAS) y acetil-CoA carboxilasa (ACC) en el hígado de pollo17, y niveles elevados de FAS y ACC aumentan la producción de ácidos grasos, que se incorporan a los triglicéridos y aumentan la deposición de grasa18. Klebsiella y Escherichia-Shigella poseen características de lipogénesis, y su mayor abundancia aumenta las concentraciones séricas de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad y triglicéridos, lo que facilita la acumulación de grasa19. Por otro lado, alguna microbiota como Mucispirillum schaedleri disminuye la deposición de grasa en pollos4, y Sphaerochaeta se encuentra enriquecida en pollos magros14. Lactobacillus johnsonii BS15 disminuye la deposición de grasa a través de la actividad de la lipoproteína lipasa (LPL) y mejora el catabolismo de la grasa en pollos de engorde20. La abundancia de Microbacterium y Sphingomonas en el pollo se relacionó positivamente con los genes del catabolismo de las grasas en los músculos y el hígado, lo que potencialmente reduce el almacenamiento de grasa21. Estudios previos indicaron que la microbiota intestinal no solo puede aumentar la deposición de grasa, sino que también puede disminuir la deposición de grasa4,14. En la compleja red de comunidades microbianas intestinales, dinámicamente la mayor diversidad bacteriana se observa en el ciego22. Por lo tanto, cuál es la composición bacteriana cecal y qué tipo de bacterias cecales podrían reducir la deposición de grasa abdominal, y cómo regulan el metabolismo de las grasas se ha convertido en una pregunta interesante.

Para abordar esta preocupación, en el presente estudio se utilizaron pollos (Turpan gallos de pelea × White Leghorn) de tres edades diferentes (1 mes, 4 meses y 12 meses) con una deposición de grasa abdominal significativamente diferente. Se compararon los niveles de metabolismo de las grasas, las comunidades microbianas cecales y la abundancia de diferentes bacterias entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal. Se utilizó el análisis de correlación de Spearman para encontrar la relación entre la microbiota cecal y el depósito de grasa abdominal. Además, se transfirió la microbiota fecal de pollos adultos sanos con baja deposición de grasa abdominal a pollos de engorde de pluma blanca de 1 día de edad para verificar si la microbiota intestinal podía regular la deposición de grasa de los pollos, y se determinaron los niveles de metabolismo de las grasas en el hígado y los tejidos adiposos abdominales. también comparado.

Con base en el índice de grasa abdominal, los pollos (Turpan pelea de gallos × White Leghorn) a diferentes edades (1 mes, 4 meses y 12 meses) se dividieron en pollos con alta deposición de grasa abdominal (grupo H) y pollos con baja deposición de grasa abdominal. pollos (grupo L) respectivamente. El volumen de grasa abdominal (Fig. 1a), peso de la grasa abdominal (H vs L, 1 mes: 4,33 ± 0,31 g vs 1,12 ± 0,09 g; 4 meses: 9,58 ± 0,56 g vs 1,15 ± 0,08 g; 12 meses: 63,77 ± 6,19 g vs 19,46 ± 2,77 g) (prueba t de Student no pareada, p < 0,0001) (fig. 1b), e índice de grasa abdominal (H vs L, 1 mes: 1,63 ± 0,12% vs 0,48 ± 0,45%; 4 meses: 1,04 ± 0,07 % frente a 0,13 ± 0,01 %, 12 meses: 3,11 ± 0,22 % frente a 0,94 ± 0,13 % (pruebas t de Student para datos no apareados, p < 0,0001) (fig. 1c) fueron significativamente mayores en la deposición de grasa abdominal alta pollos Los resultados de la tinción con hematoxilina y eosina (HE) mostraron que el diámetro promedio de los adipocitos abdominales fue significativamente mayor en pollos con alta deposición de grasa abdominal que en pollos con baja deposición de grasa abdominal (pruebas t de Student no apareadas, p <0,0001) (Fig. 1d). Los resultados anteriores mostraron que hubo diferencias significativas en la deposición de grasa entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal.

a La comparación del volumen de grasa abdominal entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal en diferentes meses. b La comparación del peso de la grasa abdominal entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal en diferentes meses. c La comparación del índice de grasa abdominal entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal en diferentes meses. d Secciones de tinción HE de tejidos adiposos abdominales grasos y la comparación de un diámetro promedio de adipocitos en pollos con deposición de grasa abdominal alta y baja en diferentes meses. Barras de escala = 100 μm. H representa pollos con grasa abdominal alta (n = 10), y L representa pollos con grasa abdominal baja (n = 10). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. **** p < 0,0001.

Se ha establecido que el metabolismo graso desequilibrado está estrechamente relacionado con el depósito de grasa abdominal, por lo que se compararon los niveles de metabolismo graso en sangre (TG, CT, LDL-C y HDL-C), grasa abdominal e hígado entre altos y bajos. Deposición de grasa abdominal en pollos de diferentes edades (1 mes, 4 meses y 12 meses). En sangre, las concentraciones de TG (4 meses: p = 0,0025), TC (12 meses: p = 0,0406) y LDL-C (1 mes: p = 0,0273, 12 meses: p = 0,0183) fueron marcadamente más alta en pollos con alta deposición de grasa abdominal en algunos puntos de tiempo, sin embargo, la concentración de HDL-C (1 mes de edad: p = 0.0436, 4 meses de edad: p = 0.0392, 12 meses de edad: p = 0.0483) fue significativamente mayor en baja pollos con deposición de grasa abdominal en todos los puntos de tiempo (Fig. 2a). En la grasa abdominal, las expresiones relativas de ARNm de algunos genes relacionados con la síntesis de grasa, como ACC, FAS y LPL, fueron notablemente más altas (pruebas t de Student no apareadas, p < 0,05) en pollos con alta deposición de grasa abdominal en todos los puntos temporales (Fig. . 2b), sin embargo, la expresión relativa del ARNm del gen relacionado con el catabolismo de las grasas de la lipasa sensible a hormonas (HSL) fue significativamente mayor (4 meses de edad: p = 0,0131, 12 meses de edad: p = 0,0197) más alta en pollos con baja deposición de grasa abdominal al principio. edad de 4 y 12 meses (Fig. 2c). En el hígado, el número de grasa vesicular hueca fue mayor en pollos con alta deposición de grasa abdominal (Fig. 3a). Las expresiones relativas de ARNm de los genes relacionados con la síntesis de grasa, incluido el miembro 1 de la familia de cadena larga de la acil-CoA sintetasa (ACSL1), la desaturasa de ácidos grasos 1 (FADS1) y el citocromo P450 2C45 (CYP2C45), fueron significativamente más altas en pollos con alta deposición de grasa abdominal. puntos de tiempo (p < 0.05) (pruebas t de Student no apareadas, Fig. 3b). Sin embargo, la expresión relativa del ARNm del gen relacionado con el transporte de grasa de la apolipoproteína AI (APOAI) (Fig. 3c) fue significativamente mayor (1 mes: p = 0,0291, 4 meses: p = 0,0144, 12 meses: p = 0,0297) y Los genes relacionados con el catabolismo de las grasas, incluidos el receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas (PPARα), la carnitina palmitoil transferasa 1 (CPT-1), el receptor de leptina (LEPR), la Janus quinasa 2 (JAK2) y el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) fueron significativamente (pruebas t de Student no pareadas, p < 0,05) más altas en pollos con baja deposición de grasa abdominal en diferentes momentos (Fig. 3d). Además, los niveles de expresión proteica de p-JAK2 (1 mes: p = 0,0005, 4 meses: p = 0,0345, 12 meses: p = 0,00014) y p-STAT3 (1 mes: p = 0,0217, 4 meses de edad: p = 0,0328, 12 meses de edad: p = 0,0205) fueron significativamente mayores en pollos con baja deposición de grasa abdominal en todos los puntos temporales (Fig. 4).

a La comparación de las concentraciones séricas de triglicéridos (TG) (mmol/L), las concentraciones séricas de colesterol total (TC) (mmol/L), las concentraciones séricas de LDL-C (mmol/L) y las concentraciones séricas de HDL-C (mmol/L ) entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a los 1, 4 y 12 meses. b La comparación de la expresión relativa de ARNm de genes relacionados con la síntesis de grasa entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a 1, 4 y 12 meses (q-PCR). c La comparación de la expresión relativa del ARNm de los genes relacionados con el catabolismo de las grasas entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a 1, 4 y 12 meses (q-PCR). H representa pollos con grasa abdominal alta (n = 10), y L representa pollos con grasa abdominal baja (n = 10). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01.

a Secciones de tinción HE del contenido de grasa en hepatocitos de los pollos a 1, 4 y 12 meses. Las gotas de grasa (blancas) se indican con flechas en las figuras. b La comparación de la expresión relativa de ARNm de genes relacionados con la síntesis de grasa entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a 1, 4 y 12 meses (q-PCR). c La comparación de la expresión relativa de ARNm de genes relacionados con el transporte de grasa entre los pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a 1, 4 y 12 meses (q-PCR). d La comparación de la expresión relativa del ARNm de los genes relacionados con el catabolismo de las grasas entre los pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a los 1, 4 y 12 meses (q-PCR). Barras de escala = 50 μm. H representa pollos con grasa abdominal alta (n = 10), y L representa pollos con grasa abdominal baja (n = 10). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. * p < 0,05.

La distribución de proteínas y los niveles de expresión de JAK2, p-JAK2, STAT3, p-STAT3 en pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a los 1, 4 y 12 meses de edad, respectivamente (IHC). Barras de escala = 50 μm. H representa pollos con grasa abdominal alta (n = 10), y L representa pollos con grasa abdominal baja (n = 10). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001.

Se utilizó la secuenciación del gen 16S rRNA para comparar la composición de la microbiota cecal entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal en diferentes momentos. El análisis de diversidad alfa indicó que la diversidad microbiana (Fig. 5a) y la abundancia de la comunidad (Fig. 5b) en la deposición de grasa abdominal alta fueron más altas que en los pollos con deposición de grasa abdominal baja. La diversidad beta exhibió una separación distinta entre pollos con deposición de grasa abdominal alta y baja en diferentes puntos de tiempo (análisis ANOSIM, p < 0.05; Fig. 5c). A nivel de filo, Firmicutes fue más abundante en pollos con alta deposición de grasa abdominal, mientras que Bacteroidetes fue más abundante en pollos con baja deposición de grasa abdominal en todos los puntos de tiempo (Fig. 6a). A nivel de género, la abundancia relativa de Parabacteroides (4 meses: p = 0,0003, 12 meses: p = 0,0131), Parasutterella (1 mes: p = 0,0083, 4 meses: p = 0,0041, 12 meses: p = 0,0041, 12 meses: p = 0,0390), Oscillibacter (1 mes: p = 0,0134, 4 meses: p = 0,0384) y Anaerofustis (4 meses: p = 0,0137, 12 meses: p = 0,0079) fue significativamente mayor en grasa abdominal alta pollos de deposición (Fig. 6b), mientras que la abundancia relativa de Sphaerochaeta fue mayor en pollos con baja deposición de grasa abdominal (Fig. 6c y Fig. 2 complementaria).

La comparación de la diversidad de la comunidad microbiana medida con el índice de Shannon a y el índice de Chao b entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal en diferentes meses. c La comparación del análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en OTU entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a los 1, 4 y 12 meses. H representa pollos con grasa abdominal alta (n = 10), y L representa pollos con grasa abdominal baja (n = 10). La línea central representa la mediana, los límites de la caja representan el primer y tercer cuartil, y el bigote muestra los valores mínimo y máximo, y la significación estadística entre los grupos se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (a, b). El análisis ANOSIM (Análisis de similitudes) se usa para probar si la diferencia entre grupos (dos o más grupos) es significativamente mayor que la diferencia dentro del grupo, para juzgar si la agrupación es significativa (c). *p < 0,05, **p < 0,01.

a Composición de la comunidad de microbiota cecal a nivel de filo en pollos en diferentes (1, 4 y 12) meses. b, c La comparación de la abundancia relativa de géneros objetivo (Parabacteroides, Parasutterella, Oscillibacter, Anaerofustis, Sphaerochaeta) entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal en diferentes (1, 4 y 12) meses, respectivamente. H representa pollos con grasa abdominal alta (n = 10), y L representa pollos con grasa abdominal baja (n = 10). La significancia estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados (b, c). Todos los datos se presentaron como media ± SEM. *p < 0,05 **p < 0,01, ***p < 0,001.

La asociación entre la microbiota cecal y las enzimas activas de carbohidratos (CAZymes), incluidas las glucósido hidrolasas (GH), las glicosiltransferasas (GT), las esterasas de carbohidratos (CE), las actividades auxiliares (AA), los módulos de unión a carbohidratos (CBM) y polisacárido liasas (PL). ) fue analizado. Firmicutes y Bacteroidetes codificaron más del 85% de las principales CAZimas. En comparación con los pollos con alta deposición de grasa abdominal, Firmicutes codificó menos CAZimas, pero Bacteroidetes codificó más CAZimas en pollos con baja deposición de grasa abdominal (Fig. 7a). Un análisis posterior indicó que se encontraron 25 CAZimas con recuentos más altos en pollos con alta deposición de grasa abdominal, y 19 de ellos son GH. Se encontraron recuentos más altos de otras 25 CAZimas en pollos con baja deposición de grasa abdominal, 12 son GH y 10 son GT (Fig. 7b). El análisis KEGG mostró que los genes expresados diferencialmente se anotaron en 58 vías diferentes. Las vías del metabolismo de los carbohidratos, incluido el metabolismo del almidón y la sacarosa, el metabolismo del piruvato, la interconversión de pentosa y glucuronato, el metabolismo del ácido dibásico de cadena ramificada C5 y el metabolismo del propanoato, se encontraron recuentos más altos en pollos con alta deposición de grasa abdominal. Se encontraron recuentos más altos en las vías del metabolismo de los lípidos, incluida la biosíntesis de ácidos grasos y la degradación de ácidos grasos, en pollos con baja deposición de grasa abdominal (Fig. 7c).

a La comparación de la contribución relativa de la microbiota cecal (a nivel de filo) a las enzimas activas de carbohidratos (CAZymes) entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal. b La comparación de las actividades enzimáticas de carbohidratos de la microbiota cecal entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal. c La comparación de las vías diferenciales KEGG de microbiota cecal entre pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal. H representa pollos con grasa abdominal alta (n = 10), y L representa pollos con grasa abdominal baja (n = 10). Puntuación LDA (log10) > 2,0.

Se utilizó el análisis de correlación de Spearman para analizar la correlación entre la microbiota cecal y el peso/índice de grasa abdominal y los niveles de metabolismo de las grasas. Los resultados indicaron que la abundancia de Parabacteroides, Parasutterella, Oscillibacter y Anaerofustis fue significativa (pruebas de correlación de Spearman, p < 0,05) y se correlacionó positivamente con el peso/índice de grasa abdominal y la expresión de genes relacionados con la síntesis de grasa en el hígado y la grasa abdominal. mientras que significativamente (pruebas de correlación de Spearman, p < 0,05) y negativamente se correlacionó con la expresión de genes relacionados con el transporte de grasa y el catabolismo en el hígado y la grasa abdominal. Además, la abundancia de Sphaerochaeta se correlacionó positivamente con la expresión de genes relacionados con el catabolismo y el transporte de grasa en el hígado y la grasa abdominal y se correlacionó negativamente con el peso/índice de grasa abdominal (Fig. 8).

La asociación de diferentes bacterias con el depósito de grasa abdominal y sus factores de acumulación de grasa relacionados a los 1, 4 y 12 meses de edad. El color rojo indica correlación positiva y el color azul indica correlación negativa. *p < 0,05, **p < 0,01.

Para verificar los efectos de la microbiota intestinal en la deposición de grasa abdominal de los pollos, se trasplantó la microbiota fecal de pollos adultos con alta o baja deposición de grasa abdominal a pollitos de 1 día de edad. Las tendencias crecientes del peso corporal (Fig. 9a), el peso muscular de la mama/pierna (Fig. 9b) y el índice muscular de la mama/pierna (Fig. 9c) se observaron en los grupos FMT en comparación con el grupo de control. Cuatro semanas de FMT de pollo con alta deposición de grasa abdominal aumentaron significativamente el peso de la grasa abdominal (H-FMT: 22,29 ± 1,59 g frente a Con: 18,19 ± 0,79 g) (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0286) (Fig. 9d) y grasa abdominal índice (H-FMT: 1,44 ± 0,06% frente a Con: 1,23 ± 0,04%) (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0050) (Fig. 9e). Curiosamente, cuatro semanas de FMT de pollo con baja deposición de grasa abdominal redujeron significativamente el peso de la grasa abdominal (L-FMT: 15,18 ± 1,05 g frente a Con: 18,19 ± 0,79 g) (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0278) (Fig. 9d) y índice de grasa abdominal (L-FMT: 1,02 ± 0,06 % frente a Con: 1,23 ± 0,04 %) (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0072) (fig. 9e). Además, L-FMT disminuyó el volumen de grasa abdominal (Fig. 9f). Los resultados de la tinción HE indicaron que el diámetro promedio de los adipocitos abdominales fue significativamente menor en el grupo L-FMT que en el grupo control (pruebas t de Student no apareadas, p <0.0001) (Fig. 9g, h) y el número de grasa vesicular hueca en el hígado fue notablemente menor en el grupo L-FMT (Fig. 9i). Los resultados anteriores indicaron que FMT podría cambiar significativamente la deposición de grasa de pollo.

a Una tendencia creciente del peso corporal en los grupos H-FMT y L-FMT en comparación con el grupo de control. b Una tendencia creciente del peso muscular de la mama y la pierna en los grupos H-FMT y L-FMT en comparación con el grupo de control. c Una tendencia creciente del índice muscular de la mama y la pierna en los grupos H-FMT y L-FMT en comparación con el grupo de control. d La comparación del peso de la grasa abdominal entre los grupos de control, H-FMT y L-FMT. e La comparación del índice de grasa abdominal entre los grupos control, H-FMT y L-FMT. f La comparación de los tejidos grasos abdominales de pollos entre los grupos de control y L-FMT. g, h Secciones de tinción HE de tejidos adiposos abdominales y la comparación de un diámetro promedio de adipocitos entre los grupos de control y L-FMT. Secciones de tinción i HE del contenido de grasa en hepatocitos de los pollos. Barras de escala (g) = 100 μm, Barras de escala (i) = 50 μm. Con representa el grupo de control (n = 30), H-FMT representa el grupo de trasplante de microbiota fecal del pollo con alta deposición de grasa abdominal (n = 30), L-FMT representa el grupo de trasplante de microbiota fecal del pollo con baja deposición de grasa abdominal (n = 30). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Para verificar los efectos de L-FMT en el metabolismo de las grasas de los receptores, se investigaron los niveles de metabolismo de las grasas en la grasa abdominal y el hígado. En la grasa abdominal, los resultados de qPCR mostraron que L-FMT regulaba significativamente a la baja la expresión relativa del ARNm de los genes relacionados con la síntesis de grasa (FAS (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0313) y LPL (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0283)) , y reguló al alza la expresión relativa de ARNm de HSL (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0283) (Fig. 10a). En el hígado, los resultados de qPCR mostraron que L-FMT regulaba significativamente a la baja la expresión relativa del ARNm de los genes relacionados con la síntesis de grasa, ACC (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0429), FAS (pruebas t de Student no apareadas, p = 0,0192)), y aumentó significativamente la expresión relativa de ARNm de APOAI (pruebas t de Student no pareadas, p = 0,0422) y genes relacionados con el catabolismo de grasas (PPARα, CPT-1, LEPR, JAK2 y STAT3) (pruebas t de Student no pareadas, p < 0,05 ) (Figura 10b). Los resultados de tinción de inmunohistoquímica (IHC) indicaron que L-FMT regulaba significativamente la expresión proteica de p-JAK2 (pruebas t de Student no pareadas, p = 0,0115) y p-STAT3 (pruebas t de Student no pareadas, p = 0,0055) en el hígado (Fig. 10c).

La comparación de los niveles de metabolismo de las grasas en la grasa abdominal y el hígado de pollo entre los grupos de control y L-FMT. a La comparación de la expresión relativa del ARNm de los genes relacionados con la síntesis de grasa y los genes relacionados con el catabolismo de la grasa en la grasa abdominal (q-PCR). b La comparación de la expresión relativa de ARNm de genes relacionados con la síntesis de grasas, genes relacionados con el transporte de grasas y genes relacionados con el catabolismo de grasas en el hígado (q-PCR). c La distribución de proteínas y los niveles de expresión de JAK2, p-JAK2, STAT3 y p-STAT3 en el hígado (IHC). Barras de escala = 50 μm. Con representa el grupo de control (n = 14), y L-FMT representa el grupo de trasplante de microbiota fecal del pollo con baja deposición de grasa abdominal (n = 14). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados. Todos los datos se presentaron como media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01.

Los resultados de la secuenciación del gen 16 S rRNA mostraron que L-FMT aumentó significativamente la abundancia de la comunidad microbiana cecal (índice de Chao) (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p < 0,0001) (Fig. 11a), cambió la composición de la microbiota cecal (análisis ANOSIM, p < 0,001) (Fig. 11b), aumentó la abundancia relativa de Bacteroidetes y disminuyó la abundancia relativa de Firmicutes (Fig. 11c). Además, L-FMT significativamente (pruebas t de Student no pareadas, p = 0.0078) disminuyó la abundancia relativa de Parabacteroides y significativamente (pruebas t de Student no pareadas, p = 0.0298) aumentó la abundancia relativa de Sphaerochaeta en comparación con el grupo de control (Fig. 11d y Figura complementaria 3).

Para la secuenciación del ARNr 16S, se seleccionaron al azar 28 pollos de engorde de pluma blanca (14 en cada grupo con machos y hembras iguales) para el análisis de la microbiota cecal en los grupos de control y L-FMT. a La comparación del índice de Chao. b Análisis de análisis de coordenadas principales (PCoA). c Composición de la comunidad de microbiota cecal a nivel de filo. d La abundancia relativa de Parabacteroides y Sphaerochaeta. Con representa el grupo de control (n = 14), y L-FMT representa el grupo de trasplante de microbiota fecal del pollo con baja deposición de grasa abdominal (n = 14). La línea central representa la mediana, los límites de la caja representan el primer y tercer cuartil, el bigote muestra los valores mínimo y máximo y la significación estadística entre grupos se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (a). El análisis ANOSIM (Análisis de similitudes) se usa para probar si la diferencia entre grupos (dos o más grupos) es significativamente mayor que la diferencia dentro del grupo, para juzgar si la agrupación es significativa (b). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas y los datos se presentaron como media ± SEM (d). *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001.

El metabolismo de grasas estable libera energía para aumentar el crecimiento, pero el metabolismo de grasas inestable a menudo resulta en una deposición de grasa innecesaria23. El metabolismo de las grasas es un mecanismo bioquímico complejo en el que la digestión, la asimilación y el transporte de las grasas ocurren a través de varias reacciones anabólicas y catabólicas21. La grasa digerida se procesa posteriormente en forma de ácidos grasos y glicerol21. Por ejemplo, los ácidos grasos y el glicerol producidos son absorbidos en el epitelio intestinal y transportados a través de la circulación sanguínea al hígado, tejido adiposo y otros órganos21. La síntesis de grasas en los órganos está regulada por genes relacionados con la síntesis de grasas, incluidos FAS, ACSL1, FADS1, CYP2C45 y LPL24. Para comprender el impacto de la vía del anabolismo de las grasas en el metabolismo de las grasas, se elucidó la expresión de los genes relacionados con el anabolismo de las grasas. En el presente estudio, se encontró una expresión relativa significativamente mayor de ARNm de FAS, ACSL1, FADS1, CYP2C45 y LPL en el hígado y la grasa abdominal de pollos con alta deposición de grasa abdominal, lo que sugiere una mayor síntesis de grasa, lo que tendría una estrecha relación con la deposición de grasa. en pollos También se ha informado que niveles elevados de ACSL1, ACC y FAS están asociados con la deposición de grasa a través del aumento de los niveles séricos de TG, TC y LDL-C25,26. En el presente estudio, el aumento de los niveles séricos de TG, TC y LDL-C y la disminución significativa de los niveles séricos de HDL-C en pollos con alta deposición de grasa abdominal son consistentes con los hallazgos en ratones27 y en pollos28,29, lo que indica que la deposición de un una mayor cantidad de grasa abdominal también alteraría los niveles de TG, TC, HDL-C y LDL-C en el suero de pollo. Además, también se ha demostrado que los genes del catabolismo de las grasas contribuyen significativamente al metabolismo de las grasas. Por ejemplo, CPT-1 y PPARα son genes catabólicos que estimulan la oxidación de ácidos grasos, lo que resulta en la producción de energía para el crecimiento de los pollos30. En el presente estudio, una expresión de ARNm hepático significativamente regulada a la baja de CPT-1 y PPARα y una expresión más baja de JAK2 a través de la activación de STAT3 en pollos con alta deposición de grasa abdominal aumentó notablemente la deposición de grasa abdominal en pollos de engorde31,32. En particular, se predice que niveles elevados de APOAI y HSL y niveles más altos de HDL-C en suero en pollos con bajo depósito de grasa abdominal en nuestro estudio facilitarán la excreción de grasa porque HSL actúa como un limpiador y, junto con APOAI, transporta colesterol/ácidos grasos desde los depósitos de grasa al hígado. para la lipólisis, reduciendo la acumulación de grasa en pollos de engorde33,34,35. Además, los genes relacionados con la diferenciación de adipocitos sobrerregulados aumentan su proliferación y contribuyen significativamente a la deposición de grasa abdominal en pollos5,21. Un diámetro promedio significativamente más alto de adipocitos abdominales en pollos con alta deposición de grasa abdominal en nuestro estudio, indica el papel crucial de la diferenciación de adipocitos en la deposición de grasa36. Por lo tanto, más síntesis de grasa y menos catabolismo de grasa dieron como resultado una deposición excesiva de grasa y viceversa.

Se ha establecido que la microbiota intestinal podría controlar el depósito de grasa abdominal al regular el metabolismo de las grasas6. Por ejemplo, la abundancia de Parabacteroides se correlaciona positivamente con la masa grasa en individuos obesos37,38. Parasutterella causa síndrome del intestino irritable e inmunosupresión en pollos39, y aumenta el porcentaje/deposición de grasa abdominal40. Oscillibacter es abundante en pollos de línea gorda41 y está asociado con la obesidad42. Asimismo, una mayor abundancia de Anaerofustis en el ciego de ratones con dieta rica en grasas43 y de pollos de engorde durante la infección inducida por Clostridium perfringens44 está relacionada con el metabolismo de las grasas. Estudios recientes revelaron que las bacterias descritas anteriormente interactúan estrechamente con los genes relacionados con el metabolismo de las grasas y los parámetros TG, TC, LDL-C y HDL-C para alterar la deposición de grasa. Por ejemplo, Li et al. describieron que Parabacteroides y Oscillibacter se relacionan positivamente con FAS y ACC, mientras que negativamente con HSL45. De manera similar, ambas bacterias contribuyen a aumentar los niveles de TG hepáticos y séricos, TG, TC y LDL-C en ratones con dieta rica en grasas45, lo que indica más anabolismo de grasas en lugar de catabolismo de grasas, que se prevé que aumente la deposición de grasa. Además, Huang et al. encontró que Parasutterella está involucrada en el aumento de los niveles de TG, TC y LDL-C, mientras que disminuye los niveles de HDL-C tanto en el hígado como en el suero de ratones46, y su mayor abundancia aumenta la deposición de grasa abdominal porque Parasutterella podría descomponer los alimentos de alta energía y alterar el metabolismo de las grasas40,47. Otro estudio reciente informó que Anaerofustis también podría regular el metabolismo de las grasas, ya que se asocia positivamente con los niveles de TG, TC y LDL-C y negativamente con los niveles de HDL-C en suero48. Por lo general, estas bacterias tienen una contribución significativa a la acumulación de grasa y son consistentes con nuestros hallazgos de pollos con alta deposición de grasa abdominal, lo que indica que una mayor abundancia de estas bacterias en el intestino del huésped podría aumentar la deposición de grasa. Curiosamente, también se han encontrado algunas otras bacterias que se comportan de manera diferente en comparación con las descritas anteriormente. Por ejemplo, Sphaerochaeta tiene una relación importante con la disminución de la deposición de grasa en los cerdos49 y se reconoce como una especie central para regular el metabolismo de los lípidos50. Un estudio reciente encontró que Sphaerochaeta se enriquece significativamente en pollos magros14, lo que también es consistente con nuestros hallazgos. Además, Huang et al. informó que Sphaerochaeta está positivamente relacionado con el nivel sérico de HDL-C y negativamente con el nivel de TC y podría mejorar el metabolismo de las grasas51. Feng et al. también describieron que una mayor abundancia de Sphaerochaeta regula notablemente el metabolismo de la grasa corporal y podría controlar la deposición de grasa abdominal en el pollo amarillo Xianju52, lo que indica que Sphaerochaeta podría afectar el metabolismo de la grasa y la deposición de grasa. Por lo tanto, se prevé que una mayor abundancia de Parabacteroides, Parasutterella, Oscillibacter y Anaerofustis provoque una mayor tendencia a la deposición de grasa en pollos con una alta deposición de grasa abdominal a través del anabolismo graso, mientras que una mayor abundancia de Sphaerochaeta se espera que disminuya la tendencia a la deposición de grasa en pollos con una baja deposición de grasa abdominal. a través del catabolismo de las grasas.

Se ha establecido que la microbiota intestinal podría codificar CAZimas para regular el depósito de grasa14,53. La microbiota intestinal degrada principalmente el almidón resistente y las fibras dietéticas a través de la hidrólisis14,53 y cumple esta función a través del metabolismo de los carbohidratos mediante el uso de GH, GT, CE, PL y CBM54,55. Por lo general, el metabolismo de los carbohidratos está interrelacionado con la deposición de grasa porque las calorías más altas producidas por el metabolismo de los carbohidratos pueden causar lipogénesis de novo y una gran conversión de glucosa en piruvato (glucólisis) o en TG23,42,56. Se ha informado que Oscillibacter tiene una gran cantidad de genes GH y CBM para escindir los polisacáridos complejos y también podría regular la deposición de grasa41,57,58. En el presente estudio, tanto Anaerofustis como Oscillibacter (Firmicutes) se encuentran significativamente enriquecidas en pollos con alta deposición de grasa abdominal, lo que predice que estas bacterias extrajeron energía adicional mediante el uso de CAZymes y la transportaron a los tejidos adiposos, lo que resultó en una deposición excesiva de grasa abdominal. Otros estudios también encontraron una asociación positiva de Anaerofustis y Oscillibacter con la digestibilidad de la fibra y la obesidad59,60. Por otro lado, Xiang et al. encontró que Sphaerochaeta podría promover considerablemente las actividades de CAZyme y regular el metabolismo de los lípidos en los pollos magros14, lo cual está de acuerdo con nuestros hallazgos de que Sphaerochaeta como miembro único podría disminuir la deposición de grasa abdominal a través de las actividades de CAZymes (GH, GT, CE, AA y CBM) . La evidencia revela que Sphaerochaeta pertenece al filo Spirochaetes61 y varios estudios describieron que Sphaerochaeta también podría producir β-xilosidasas de la familia GH, procesar polímeros de carbohidratos a través del metabolismo de carbohidratos y tuvo una contribución significativa para regular la deposición de grasa50,62,63. Por lo tanto, se anticipa que Sphaerochaeta tiene un potencial significativo en el control de la deposición de grasa abdominal a través de la codificación de CAZymes.

Cada vez más pruebas indicaron que la remodelación de la microbiota intestinal mediante el trasplante de microbiota fecal (FMT, por sus siglas en inglés) podría reducir la acumulación de grasa abdominal al regular el metabolismo de las grasas14,64. De acuerdo con estos hallazgos, el presente estudio también observó que el FMT del pollo con baja deposición de grasa abdominal redujo significativamente la deposición de grasa abdominal (tanto el peso como el índice de grasa abdominal) y reguló notablemente el metabolismo de las grasas. Además, se informó que Sphaerochaeta se enriqueció en pollos magros y Parabacteroides se enriqueció en individuos obesos14,37. Asimismo, se observó una mayor abundancia de Sphaerochaeta y una menor abundancia de Parabacteroides en el grupo L-FMT del presente estudio, lo que es consistente con nuestros resultados en pollos con baja deposición de grasa abdominal, lo que indica que estas bacterias podrían alterar la deposición de grasa abdominal y controlarla. metabolismo de la grasa. Otros estudios también describieron que FMT podría atenuar significativamente la deposición de grasa en ratones con dieta rica en grasas65 porque un nivel más bajo de LPL disminuye la adipogénesis al reducir la hidrólisis de triglicéridos en los tejidos adiposos66. En el presente estudio, disminuyó significativamente la expresión de genes relacionados con el anabolismo (FAS, LPL en grasa abdominal y ACC, FAS en el hígado) y aumentó significativamente la expresión de genes relacionados con el catabolismo (PPARα hepático, CPT-1, LEPR, JAK2 y STAT3) se encontraron en el grupo L-FMT en comparación con el control. Además, también se observó una expresión significativamente mayor de HSL en grasa abdominal y APOAI, p-JAK2 y p-STAT3 en hígado del grupo L-FMT. Los resultados indicaron que la microbiota fecal de los pollos con baja deposición de grasa abdominal podría aumentar la abundancia de Sphaerochaeta, lo que promovió el catabolismo de las grasas al mejorar las expresiones de los genes relacionados con el catabolismo y el transporte de grasas67.

En conjunto, los hallazgos actuales indicaron que el metabolismo desequilibrado de las grasas conduce a una deposición excesiva de grasa abdominal. Las abundancias de Parabacteroides, Parasutterella, Oscillibacter y Anaerofus se correlacionan con la expresión positiva de los genes del anabolismo de la grasa, lo que eventualmente aumenta la deposición de grasa abdominal. Sin embargo, la abundancia de Sphaerochaeta aumenta la expresión de los genes del catabolismo de la grasa, lo que reduce la acumulación de grasa abdominal y beneficia el crecimiento muscular de los pollos. Además, L-FMT disminuyó significativamente Parabacteroides, aumentó Sphaerochaeta y reguló al alza la expresión de genes de catabolismo de grasas. L-FMT podría aplicarse como una estrategia para reducir la acumulación de grasa abdominal y al mismo tiempo promover el crecimiento de los músculos.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Huazhong (HZAUCH-2018-008), Wuhan, China, aprobó todos los procedimientos con animales y todos los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes.

Los pollos recién nacidos (Turpan gallos de pelea × White Leghorn) se criaron en condiciones de cría similares en la granja de pollos de la Universidad Agrícola de Huazhong. A la edad de 1, 4 y 12 meses, se seleccionaron al azar 120 pollos para cada punto de tiempo. Según el índice de grasa abdominal, los pollos en cada momento se clasificaron en dos grupos, a saber, el grupo de depósito de grasa abdominal alto (H) y el grupo de depósito de grasa abdominal bajo (L) (n = 10, 5 machos y 5 hembras) . Para el experimento FMT, los pollos con alto peso corporal, baja deposición de grasa abdominal y alta deposición de grasa abdominal fueron seleccionados por separado como donantes de FMT. Se seleccionaron como receptores un total de 90 pollos de engorde de pluma blanca de un día de edad.

Se escanearon dos hembras adultas de pollo Leghorn blanco × pollos de pelea Turpan que posiblemente tenían una deposición de grasa abdominal alta o baja con un instrumento de tomografía computarizada (TC) (Aquilion PRIME Tsx-303A, Canon Medical, Japón). Se usó el software Pari para marcar la grasa abdominal en diferentes cuadros de imágenes de cada pollo (Fig. 1 complementaria), y luego se usó el lenguaje Python para escribir programas para analizar las imágenes y calcular el volumen del cuerpo y la grasa abdominal de cada pollo. El volumen del cuerpo fue de 2,22 dm3 y 2,50 dm3, y el volumen de grasa abdominal fue de 0,06 dm3 y 0,15 dm3, respectivamente. De igual forma, el porcentaje de volumen de grasa abdominal fue de 2,66% y 5,92%. El pollo con menor porcentaje de volumen de grasa abdominal se seleccionó como donante del grupo L-FMT y el pollo con mayor porcentaje de volumen de grasa abdominal se seleccionó como donante del grupo H-FMT. Después del experimento FMT, se diseccionaron los dos pollos para obtener el peso y el índice de grasa abdominal. El peso de la grasa abdominal fue de 74,3 gy 161,2 g, y el índice de grasa abdominal fue del 3,12 % y el 5,78 %, respectivamente, que son consistentes con los resultados de la TC e indicaron que la selección del donante FMT es adecuada.

Todas las mañanas, una vez defecadas las gallinas donantes, se retiraba la parte blanca de las heces por contener ácido úrico. Luego se recogieron 10 g de heces en el tubo estéril (50 mL) y se mezclaron suavemente con 60 mL de solución salina normal al 0,75%. La mezcla se mantuvo en hielo para sedimentar los precipitados. Se obtuvo el sobrenadante y se filtró con gasa estéril para obtener suspensión fecal.

Un total de noventa pollos de engorde de pluma blanca de 1 día de edad fueron seleccionados como receptores y divididos aleatoriamente en grupo de control, grupo H-FMT y grupo L-FMT (n = 30). Los pollos fueron alimentados con una dieta de maíz y soja en forma de gránulos sin medicación ni vacunación. Todos los pollos se mantuvieron en la misma habitación. Desde el primer día hasta el final del experimento, se mantuvieron 2 pollos en cada jaula (longitud = 70 cm, ancho = 50 cm y altura = 60 cm). A los pollos de engorde del grupo FMT se les administró por vía oral 1 ml de suspensión de microbiota fecal, mientras que en el grupo de control se usó 1 ml de solución salina al 0,75 % como sustituto durante 28 días. A la edad de 42 días, las aves fueron sacrificadas aumentando gradualmente la inhalación de CO2 durante un período de tiempo de aproximadamente 4 a 5 minutos, luego se sacrificaron de manera humanitaria mediante la punción de la vena yugular y la recolección de la muestra de sangre al mismo tiempo. Posteriormente, se recogieron las demás muestras68.

Después de un ayuno de 12 h, los pollos se pesaron y sacrificaron, luego se recolectó sangre (a través de la vena yugular), hígado, tejido adiposo abdominal y ciego izquierdo. Para el análisis de la microbiota intestinal, el contenido cecal (1-1,5 g por ave) se recogió en dos tubos de centrífuga esterilizados (1,5 ml) y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido, luego se almacenó a -80 °C para la secuenciación. Para el análisis del parámetro lipometabólico, las muestras de sangre (3 mL por ave) se centrifugaron a 3000 × g a 4 °C durante 15 min para obtener el suero, y luego se almacenó a -80 °C para su posterior análisis. Para el análisis histomorfológico, se fijaron tejido adiposo abdominal y de hígado recién recolectados en una solución de paraformaldehído al 4%. Para el análisis de la expresión génica, partes de tejido adiposo abdominal y de hígado recién extraído se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 °C.

El índice de grasa muscular o abdominal se calculó mediante la siguiente fórmula: índice muscular = peso muscular (g)/peso corporal (g) × 100 %, índice de grasa abdominal = peso de grasa abdominal (g)/peso corporal (g) × 100 % .

El ADN genómico microbiano se extrajo del contenido cecal del pollo utilizando el kit de extracción Fast DNA SPIN (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La región hipervariable V3-V4 del gen 16S rRNA bacteriano se amplificó con los pares de cebadores 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) y 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′). La amplificación por PCR del gen 16S rRNA se realizó de la siguiente manera: una desnaturalización inicial (3 min) a 95 °C seguido de 27 ciclos de desnaturalización (30 s) a 95 °C, hibridación (30 s) a 55 °C, extensión ( 45 s) a 72 °C, y extensión simple (10 min) a 72 °C, y terminó a 4 °C. El producto de PCR se extrajo del gel de agarosa al 2 % y se purificó con el kit de extracción de gel de ADN AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante y se cuantificó con el fluorómetro Quantus™ (Promega, EE. UU.). Se utilizó la plataforma Illumina MiSeq PE300 (Illumina, San Diego, EE. UU.) para la secuenciación del gen 16S rRNA. Para 20 pollos a la edad de 4 meses con secuenciación metagenómica, el mismo extracto de ADN se fragmentó a un tamaño promedio de aproximadamente 400 pb usando Covaris M220 (Gene Company Limited, China) para la construcción de bibliotecas de extremos emparejados, que se construyó usando NEXTFLEX Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific, Austin, TX, EE. UU.). Se utilizó la plataforma Illumina NovaSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) para la secuenciación metagenómica.

Las lecturas de secuenciación del gen 16S rRNA sin procesar se desmultiplexaron, filtraron por calidad mediante fastp versión 0.20.0 y se fusionaron mediante FLASH versión 1.2.7. Las unidades taxonómicas operativas (OTU) con un límite de similitud del 97 % se agruparon mediante UPARSE versión 7.1 y las secuencias quiméricas se identificaron y eliminaron. La taxonomía de cada secuencia representativa de OTU fue analizada por RDP Classifier versión 2.2 contra la base de datos 16S rRNA (Silva 132) usando un umbral de confianza de 0.7. Para las mediciones de diversidad α y β, la profundidad de secuenciación se minimizó submuestreando las lecturas de cada muestra. Las lecturas válidas más bajas de microbiota cecal de pollos con deposición de grasa abdominal alta y baja a la edad de 1 mes fueron 25 339, la lectura efectiva más baja de microbiota cecal de pollos con deposición de grasa abdominal alta y baja a la edad de 4 meses fue 30 671 y la lectura efectiva más baja de microbiota cecal de pollos con alta y baja deposición de grasa abdominal a la edad de 12 meses fue de 45 053. De manera similar, las lecturas válidas más bajas de microbiota cecal en los pollos de control y L-FMT fueron 14 960. La diversidad α se describió utilizando el índice de Shannon y el índice de Chao. Se utilizó el análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en Bray-Curtis para estimar la disimilitud en la estructura de la comunidad. La composición de la comunidad a nivel de phylum y el cambio de abundancia a nivel de género se visualizaron mediante gráfico de barras e histograma. El tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) se realizó para detectar taxones diferencialmente abundantes en los grupos utilizando los parámetros predeterminados del análisis discriminante lineal (LDA> 2).

Las lecturas de baja calidad (longitud <50 pb o con un valor de calidad <20 o con N bases) fueron eliminadas por fastp (https://github.com/OpenGene/fastp, versión 0.20.0). Las lecturas se alinearon con el genoma del pollo mediante la herramienta de alineación Burrows-Wheeler (BWA) (http://bio-bwa.sourceforge.net, versión 0.7.9a), y se eliminó cualquier coincidencia asociada con las lecturas y sus lecturas acopladas. La secuencia optimizada se empalmó y ensambló, y se seleccionaron cóntigos ≥300 pb como resultado del ensamblaje final, y luego los cóntigos se usaron para una mayor predicción y anotación de genes. Los marcos de lectura abiertos (ORF) de cada contig ensamblado se predijeron utilizando MetaGene (http://metagene.cb.ku-tokyo.ac.jp/). Los ORF previstos con una longitud ≥100 pb se recuperaron y se tradujeron en secuencias de aminoácidos. Se construyó un catálogo de genes no redundantes utilizando CD-HIT (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/, versión 4.6.1) con una identidad de secuencia del 90 % y una cobertura del 90 %. Las lecturas después del control de calidad se asignaron al catálogo de genes no redundantes con una identidad del 95 % mediante SOAPaligner (http://soap.genomics.org.cn/, versión 2.21), y se evaluó la abundancia de genes en cada muestra. Los datos públicos utilizados para el análisis taxonómico y la clasificación funcional de genes incluyeron la base de datos integrada NCBI-NR, la base de datos KEGG y la base de datos CAZy. La secuencia de aminoácidos del gen no redundante se alineó con la base de datos NR y la base de datos KEGG respectivamente con un límite de valor e de 1e-5 utilizando Diamond (http://www.diamondsearch.org/index.php, versión 0.8.35) , y obtuvo la anotación de especie y la función KEGG correspondiente al gen. La anotación de enzimas activas en carbohidratos se realizó utilizando hmmscan (http://hmmer.janelia.org/search/hmmscan) contra la base de datos CAZy (http://www.cazy.org/) con un límite de valor e de 1e−5 .

Para el análisis de diferentes parámetros sanguíneos se determinaron las concentraciones séricas de triglicéridos (TG), colesterol total (CT), colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) y colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) mediante un analizador químico Rayto. (Chemray 800, China) según las instrucciones del fabricante (Shenzhen Rayto Life Science Co., Ltd). Brevemente, las muestras de suero se mezclaron completamente con la solución de reacción en la proporción recomendada y se mantuvieron a 37 °C durante 10 min. Finalmente, se midió la absorbancia de cada muestra y se calcularon las concentraciones totales de acuerdo con la siguiente fórmula. Concentraciones totales = Absorbancia de la muestra/Absorbancia de la solución de calibración × Concentraciones de calibración (mmol por litro).

Para la observación morfológica, se incluyeron en parafina muestras de hígado y tejido adiposo abdominal y se prepararon cortes. Los tejidos hepáticos se cortaron en secciones de 3 µm de espesor y los tejidos de grasa abdominal se cortaron en secciones de 7 µm de espesor con una cortadora rotatoria (LEICA 819, Leica, Alemania). La tinción HE se realizó de acuerdo con el protocolo de rutina y las secciones de tejido teñidas se examinaron con un microscopio óptico (BH-2, Olympus, Japón) usando una cámara digital (DP72, Olympus, Japón). Bajo un microscopio de 10 × 20, cada sección de grasa abdominal teñida con HE se utilizó para seleccionar aleatoriamente 5 campos visuales para la adquisición de imágenes. El diámetro promedio de los adipocitos de grasa abdominal se midió con image pro plus 6.0 (Media Cybernetics, EE. UU.).

Para detectar la expresión de genes relacionados con el metabolismo de las grasas a nivel de ARNm, se extrajo el ARN total del tejido adiposo abdominal y del hígado utilizando el reactivo Trizol (Takara, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN (1 μg) de cada muestra se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScript™ RT con gDNA Eraser (Takara, Japón). La mezcla de reacción de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) (10 μL) constaba de 5 μL de SYBR (Takara, Japón), 0,4 μL de cebador directo y 0,4 μL de cebador inverso, 3,2 μL de ddH2O y 1 μL de ADNc molde. La reacción de qPCR se lleva a cabo en el sistema de detección de qPCR en tiempo real Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Los pasos son los siguientes: 5 min de desnaturalización previa a 95 °C, después de 30 s de desnaturalización a 95 °C (40 ciclos), 30 s de hibridación a 60 °C y 15 s de elongación a 72 °C. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 1 con el gen de referencia (β-actina). Los niveles de expresión génica se cuantificaron utilizando el método 2−ΔΔCT.

Siguiendo los pasos descritos en estudios anteriores13, se realizó tinción inmunohistoquímica para observar la distribución y expresión de proteínas en el hígado. Brevemente, las secciones se desparafinaron dos veces en xileno y se rehidrataron en etanol de serie graduada. El antígeno se recuperó en tampón de citrato de sodio (pH 6,0) utilizando un horno de microondas (MYA-2270M, Haier, Qingdao, China) durante 18 min, es decir, 3 min a 700 W y quince min a 116 W, y luego se enfrió durante 2 –3 h a temperatura ambiente. La peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3 % (H2O2), y las secciones de tejido se incubaron con albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % (boster, China) a 37 °C durante 30 min para bloquear los sitios de unión no específicos. Luego, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios de conejo anti-JAK2 (1:100) (A11497, ABclonal Technology, Wuhan, China), conejo anti-p-JAK2 (1:100) (AP0531, ABclonal Technology, Wuhan, China). ), conejo anti-STAT-3 (1:100) (A1192, ABclonal Technology, Wuhan, China) y conejo anti-p-STAT3 (1:100) (AP0474, ABclonal Technology, Wuhan, China). Posteriormente, se usó el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Proteintech, China) para incubar las secciones de tejido durante 30 min a 37 °C. Después de la tinción con diaminobencidina (DAB) (Proteintech, China), las secciones se contrastaron con hematoxilina, se limpiaron y deshidrataron hasta que se volvieron transparentes y finalmente se sellaron con goma neutra y cubreobjetos. Finalmente, usamos un microscopio de luz (BH-2, Olympus, Japón) con una cámara digital (DP72, Olympus, Japón) para examinar las secciones. Bajo un microscopio de 10 × 40, cada sección inmunohistoquímica del hígado se utilizó para seleccionar al azar cinco campos visuales positivos para la adquisición de imágenes.

Se utilizó Image Pro Plus 6.0 para calcular la densidad óptica integral de las señales positivas. Se utilizó GraphPad Prism 6.0 (Media Cybernetics, EE. UU.) para analizar los datos de prueba. Los datos de medición se expresaron como media ± error estándar de la media (media ± SEM). La significación estadística entre los grupos se determinó mediante pruebas t de Student para datos no apareados. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.

El gen 16S rRNA sin procesar y los datos de secuenciación metagenómica están disponibles en NCBI Sequence Read Archive (SRA), bajo BioProject PRJNA837471.

El código utilizado para calcular el volumen del cuerpo del pollo y la grasa abdominal en la figura de tomografía computarizada (TC) está disponible en https://github.com/lyangfan/chicken-body-composition-calcaulation.

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El Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFE0113700) apoyó este trabajo. Agradecemos sinceramente a Yangfan Liu por ayudar en el procesamiento de datos de la figura CT.

Estos autores contribuyeron por igual: Yan Chen, Muhammad Akhtar.

Laboratorio Clave de Genética, Cría y Reproducción de Animales Agrícolas del Ministerio de Educación, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, 430070, PR China

Yan Chen, Muhammad Akhtar, Ziyu Ma, Tingwei Hu, Qiyao Liu, Hong Pan, Xiaolong Zhang, Abdallah A. Nafady y Huazhen Liu

Sección de Anatomía e Histología, Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias Veterinarias y Animales (CVAS) Jhang, Universidad de Ciencias Veterinarias y Animales (UVAS), Lahore, Pakistán

Abdur Rahman Ansari

Instituto de Investigación de Producción Animal (APRI), Centro de Investigación Agrícola (ARC), Ministerio de Agricultura, Giza, Egipto

El-Sayed M. Abdel-Kafy

Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva, Facultad de Ciencia Animal y Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, 430070, PR China

Deshi-shi

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YC y MA contribuyen igualmente como los primeros coautores. YC, MA, ZYM, TWH, QYL, HP, XLZ, AAN, ARA, E.-SMA-K., DSS y HZL contribuyeron al diseño conceptual de este proyecto y los experimentos dentro del manuscrito. YC, MA, ZYM y TWH realizaron los experimentos y el análisis de datos y contribuyeron al manejo de animales, las muestras y la recopilación de datos. MA, DSS, XLZ, AAN, ARA, E.-SMA-.K. y HZL editaron y revisaron críticamente el manuscrito. YC, MA, DSS y HZL escribieron el manuscrito. DSS y HZL supervisaron la redacción, la experimentación, el análisis, la revisión del manuscrito, la adquisición de fondos y la administración del proyecto. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Deshi Shi o Huazhen Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chen, Y., Akhtar, M., Ma, Z. et al. La microbiota cecal de pollo reduce la deposición de grasa abdominal al regular el metabolismo de las grasas. npj Biofilms Microbiomas 9, 28 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00390-8

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Recibido: 12 Septiembre 2022

Aceptado: 23 de marzo de 2023

Publicado: 30 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00390-8

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