Una vacuna de ARNm AgTRIO para mosquitos contribuye a la inmunidad contra la malaria

npj Vacunas volumen 8, Número de artículo: 88 (2023) Citar este artículo

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La malaria comienza cuando un mosquito infectado inyecta saliva que contiene esporozoitos de Plasmodium en la piel de un huésped vertebrado. Para prevenir la malaria, la vacunación es la estrategia más efectiva y existe una necesidad urgente de nuevas estrategias para mejorar las vacunas actuales basadas en patógenos. La inmunización activa o pasiva contra una proteína de la saliva del mosquito, AgTRIO, contribuye a la protección contra la infección por Plasmodium de los ratones. En este estudio, generamos una nanopartícula lipídica (LNP) de ARNm de AgTRIO y evaluamos su utilidad potencial como vacuna contra la malaria. La inmunización de ratones con un mRNA-LNP AgTRIO generó una respuesta humoral robusta, incluidos los anticuerpos del isotipo AgTRIO IgG2a que se han asociado con la protección. Los ratones inmunizados con AgTRIO mRNA-LNP expuestos a mosquitos infectados con Plasmodium berghei habían reducido notablemente los niveles iniciales de infección hepática por Plasmodium y aumentado la supervivencia en comparación con los ratones de control. Además, a medida que la respuesta humoral a AgTRIO disminuyó durante 6 meses, las picaduras adicionales de mosquitos aumentaron los títulos de AgTRIO IgG, incluidos los isotipos IgG1 e IgG2a, lo que ofrece una ventaja única en comparación con las vacunas basadas en patógenos. Estos datos ayudarán en la generación de futuras vacunas contra la malaria que pueden incluir antígenos de patógenos y vectores.

La malaria humana puede ser causada por al menos 5 especies diferentes de Plasmodium1. Para prevenir la infección, la vacunación es la estrategia más eficaz. Sin embargo, hasta la fecha no se ha desarrollado ninguna vacuna altamente eficaz contra la malaria2,3,4. Varias vacunas candidatas están en ensayos clínicos. Una de las vacunas más avanzadas, recién aprobada por la OMS en 2021, es una vacuna basada en patógenos, RTS,S. RTS,S se dirige a la proteína del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum (PfCSP) junto con los epítopos inmunoestimuladores del antígeno de superficie de la hepatitis B y el adyuvante AS015. La eficacia de la protección es moderada con una reducción del 30% al 50% de la infección en los ensayos clínicos, y la protección disminuye con el tiempo5,6,7,8. Además, la protección se limita a P. falciparum y aún existe el riesgo de infección por otras especies de Plasmodium, dos debilidades que limitan la posibilidad de erradicar la malaria9. Además, la aparición generalizada de resistencia a los medicamentos en los parásitos de la malaria y la resistencia a los insecticidas en los mosquitos vectores hace que sea imperativo desarrollar estrategias para identificar objetivos de vacunas que tengan sinergia con la CSP, o que funcionen independientemente de la CSP.

La malaria se transmite cuando un mosquito Anopheles hembra infectado ingiere sangre e inyecta esporozoitos de Plasmodium junto con saliva en la piel del huésped vertebrado10,11. Después de la picadura de un mosquito, los esporozoítos viajan dentro de los vasos sanguíneos hasta el hígado, donde invaden los hepatocitos y establecen la infección12. La saliva de los mosquitos contiene moléculas biológicamente activas que modulan las respuestas inmunitarias y hemostáticas del huésped13,14,15,16,17,18,19,20 y también pueden influir en la infección por Plasmodium. Hay informes de interacciones íntimas entre proteínas en las glándulas salivales de los mosquitos Anopheles y Plasmodium antes y después de la migración de Plasmodium fuera del mosquito21,22,23,24. También se ha demostrado que los sueros hiperinmunes contra extractos de glándulas salivales de mosquitos pueden contener anticuerpos de alto título contra componentes de la saliva que normalmente no son antigénicos durante una picadura de mosquito natural, y que dichos sueros pueden brindar cierta protección contra la transmisión de Plasmodium23. Específicamente, hemos identificado al menos un antígeno, AgTRIO de la saliva de Anopheles gambiae, que provoca anticuerpos que reducen la infección por paludismo tanto en un modelo de ratón tradicional como en un modelo de paludismo en ratón humanizado23. Los anticuerpos AgTRIO también ofrecen protección sinérgica cuando se combinan con un anticuerpo monoclonal CSP23. Estos estudios sugieren que la inmunización contra AgTRIO puede contribuir a la protección contra la infección por Plasmodium y podría ser útil en combinación con inmunógenos patógenos.

Las vacunas de ARNm son un avance tecnológico importante para prevenir enfermedades infecciosas, como lo demostró la pandemia del SARS-CoV225,26. Varios estudios que utilizaron vacunas de ARNm dirigidas a PfCSP demostraron su utilidad, aunque sin una protección completa, en modelos murinos de infección por Plasmodium27,28,29. Además, la orientación de varios antígenos es fácilmente factible utilizando vacunas de ARNm29,30,31, que potencialmente pueden generar una respuesta antipalúdica más potente para mejorar una vacuna basada en PfCSP. Hemos producido una nanopartícula lipídica (LNP) que contiene un ARNm que codifica la proteína AgTRIO de la saliva del mosquito. La inmunización de ratones C57BL/6 con la vacuna AgTRIO mRNA-LNP disminuyó la carga inicial de Plasmodium en el hígado y la parasitemia posterior, luego de la exposición a mosquitos infectados con Plasmodium. Además, la respuesta de IgG contra AgTRIO puede verse potenciada por las picaduras de mosquitos, lo que podría resolver un problema relacionado con la duración de la protección observada en las vacunas basadas en patógenos. Según estos datos, una vacuna AgTRIO mRNA-LNP puede ser útil como parte de un enfoque de vacuna multiantígeno contra la malaria.

Para determinar si AgTRIO mRNA-LNP puede generar anticuerpos específicos de AgTRIO, se inmunizaron ratones C57BL/6 tres veces con 10 μg de AgTRIO mRNA-LNP o control, Luciferase (Luc) mRNA-LNP (Fig. 1a). Dos semanas después de cada inyección, se recolectó sangre y se analizó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando un AgTRIO derivado de E. coli purificado (Fig. 1b). La inmunización con AgTRIO mRNA-LNP generó respuestas significativas de IgG después de la primera inmunización de refuerzo. Para determinar si la inmunización resultó en anticuerpos que reconocieron a AgTRIO nativo, recolectamos extractos de glándulas salivales (SGE) de hembras de Anopheles gambiae y luego cubrimos las placas con SGE para ELISA. La inmunización con AgTRIO mRNA-LNP generó anticuerpos significativos contra SGE (Fig. 1c). En nuestro estudio reciente, encontramos que la subclase IgG del anticuerpo monoclonal (mAb) AgTRIO puede influir en el efecto protector contra la infección por Plasmodium32. En particular, un mAb IgG2a murino contra AgTRIO ofreció la protección más potente32. Por ELISA, encontramos que AgTRIO mRNA-LNP generó diversos isotipos de anticuerpos contra AgTRIO, incluidos los anticuerpos IgG2a (Fig. 1d).

un Esquema experimental que muestra grupos de ratones hembra C57BL/6 inyectados con 10 μg de ARNm-LNP de AgTRIO o ARNm de control (ARNm-LNP de Luc) y reforzados dos veces, a intervalos de dos semanas. b Dos semanas después de cada inmunización, se extrajo sangre de los ratones. Se examinaron diluciones de suero 1:2500 y 1:12500 para detectar anticuerpos IgG específicos de AgTRIO mediante ELISA utilizando AgTRIO recombinante como antígeno. c Dilución 1:2500 de sueros recolectados después de que se examinaron los anticuerpos IgG específicos de AgTRIO contra extractos de glándulas salivales mediante ELISA. (Mediana ± IQR, p < 0,05 utilizando la prueba U de Mann Whitney) d Se utilizaron diluciones de suero 1:2500 para determinar IgG1, IgG2a e IgG2b específicas de AgTRIO. Se examinaron diluciones 1:500 de sueros para detectar anticuerpos IgG3 específicos de AgTRIO.

En nuestro estudio anterior, la inmunización activa con AgTRIO o la transferencia pasiva con antisueros AgTRIO ofrecieron protección parcial contra la infección por Plasmodium transmitida por mosquitos en ratones23. Para determinar si la inmunización con AgTRIO mRNA-LNP puede influir en la infección por Plasmodium, inmunizamos ratones C57BL/6 con 10 μg AgTRIO mRNA-LNP tres veces en intervalos de dos semanas. El grupo de control recibió 10 μg de Luc RNA-LNP. Tres semanas después de la última inmunización, desafiamos a los ratones usando 3 mosquitos A gambiae infectados con P. berghei cada uno. Los ratones inmunizados con AgTRIO mRNA-LNP tenían niveles hepáticos medianos de P. berghei reducidos en un 68 % en comparación con los inmunizados con Luc mRNA-LNP (Fig. 2a, p = 0,048). Para examinar más a fondo los efectos de este AgTRIO mRNA-LNP en el desarrollo de las últimas etapas de la infección por paludismo, como la parasitemia, inmunizamos un grupo adicional de ratones con 10 μg de AgTRIO mRNA-LNP o Luc mRNA-LNP tres veces y luego los expusimos los animales a tres mosquitos infectados con P. berghei. 5 días después de la exposición a las picaduras de mosquitos infectados, hubo una parasitemia significativamente menor en el grupo que recibió la vacuna AgTRIO mRNA-LNP (Fig. 2b, p = 0,012). Luego usamos las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para demostrar la cinética de la parasitemia al 0,01% como evidencia de infección (Fig. 2c). De acuerdo con la carga hepática y los resultados de parasitemia del día 5, hubo menos ratones infectados en el grupo que recibió la vacuna AgTRIO mRNA-LNP (p = 0,036 por prueba de rango logarítmico). Todos estos datos demuestran que la inmunización con AgTRIO mRNA-LNP puede reducir notablemente la carga hepática de Plasmodium en el modelo murino y contribuir a la protección contra la malaria.

Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 10 µg de ARNm-LNP de AgTRIO o ARNm de control (Luc) tres veces. 3 semanas después del último refuerzo, los ratones inmunizados fueron expuestos a 3 mosquitos infectados con P. berghei. a Después de 40 h, se diseccionaron los hígados y se determinó el nivel de infección por Plasmodium mediante RT-PCR. (Mediana ± IQR, p < 0,05 utilizando la prueba U de Mann Whitney). b En un experimento separado con ratones vacunados de la misma manera y expuestos a picaduras de mosquitos infectados, los niveles de parasitemia se determinaron el día 5 después de la infección. (Mediana ± IQR, p < 0,05 utilizando la prueba U de Mann Whitney). c Se utilizaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para presentar el porcentaje de ratones no infectados. La infección se determinó como 0,01% de parasitemia por citometría de flujo. p = 0,036 por prueba de rango logarítmico entre los dos grupos.

Dado que AgTRIO se expresa en gran medida en la saliva de los mosquitos23, luego examinamos si la disminución de las respuestas de IgG que se produce naturalmente después de cualquier vacunación puede, en el caso de AgTRIO, verse potenciada por las picaduras de mosquitos. Inmunizamos ratones C57BL/6 con tres dosis de AgTRIO mRNA-LNP y determinamos los títulos de IgG a intervalos regulares. A las 18 semanas del comienzo de los experimentos (14 semanas después de la inmunización de refuerzo final), los títulos de IgG contra AgTRIO (mediana: 0,45) habían disminuido aproximadamente un 40 % en comparación con 10 semanas después del comienzo de los experimentos (mediana: 0,716, Figura 3a). Luego, un grupo de ratones fue expuesto a 10 picaduras de mosquitos no infectados semanalmente durante 3 semanas y el grupo de control de ratones no estuvo expuesto a AgTRIO. Al alimentarse de ratones, no se observaron efectos adversos significativos durante las picaduras repetidas de mosquitos. La concentración de IgG anti-AgTRIO aumentó notablemente en el grupo expuesto a las picaduras de mosquitos, mientras que los niveles de IgG continuaron disminuyendo en el grupo de control (Fig. 3a, p = 0.03 por la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon). A continuación, determinamos qué subclases de IgG del anticuerpo específico AgTRIO se vieron potenciadas por las picaduras de mosquitos. Por ELISA, las IgG1 e IgG2a específicas de AgTRIO aumentaron significativamente después de las picaduras de mosquitos (Fig. 3b). Estos resultados muestran que las picaduras de mosquitos pueden mantener la respuesta de IgG contra AgTRIO después de la inmunización, incluidos los isotipos de IgG que se han asociado con la protección32.

A un grupo de ratones se le inyectó 10 μg de AgTRIO mRNA-LNP o control mRNA (Gluc mRNA-LNP) y se reforzó dos veces durante 4 semanas. Los sueros se recogieron a las 10, 18 y 25 semanas después del comienzo de los experimentos. Se examinó una dilución 1:2.500 de sueros para detectar anticuerpos IgG específicos de AgTRIO totales mediante ELISA. b Se utilizó una dilución de sueros de 1:2500 para determinar las IgG1, IgG2a e IgG2b específicas de AgTRIO. Se examinaron diluciones 1:500 de sueros para detectar anticuerpos IgG3 específicos de AgTRIO. (Mediana ± IQR, p < 0,05 utilizando la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon). Barra roja: expuesto a 10 mosquitos semanalmente después de 18 semanas por tres veces. Barra azul: no exposición.

Al buscar sangre, los mosquitos secretan saliva para facilitar la alimentación y los esporozoítos se liberan simultáneamente en la piel10,11. Por lo tanto, los componentes de la saliva pueden afectar directa o indirectamente la transmisión de Plasmodium en el sitio de la mordedura y son objetivos potenciales para la prevención de enfermedades23,33. En nuestros estudios anteriores, demostramos que la inmunización pasiva o activa contra una de las proteínas salivales, AgTRIO, ofrece protección parcial contra P. berghei y P. falciparum transmitidas por las picaduras de mosquitos A. gambiae o A. stephensi23. Además, demostramos que AgTRIO es altamente secretado en la saliva de los mosquitos, y los mosquitos en los que AgTRIO ha sido silenciado por ARNi no transmiten esporozoitos de manera eficiente a la piel murina en comparación con los mosquitos de control22,23. Esto convierte a AgTRIO en un candidato adecuado para su inclusión en una vacuna multicomponente. En este estudio, generamos un mRNA-LNP de AgTRIO que induce respuestas humorales específicas de AgTRIO, incluidos los anticuerpos de isotipo IgG2a que se han asociado con la protección32. El mRNA-LNP de AgTRIO redujo significativamente la infección por Plasmodium en ratones. Nuestro hallazgo indica que la inmunización contra AgTRIO, utilizando un enfoque de ARNm, puede contribuir a la protección contra la transmisión de Plasmodium del artrópodo a un huésped vertebrado.

En nuestro estudio anterior, los ratones inmunizados con proteína AgTRIO en adyuvante completo de Freund y luego reforzados con proteína AgTRIO con adyuvante incompleto de Freund tenían una carga hepática 50 % menor en comparación con el grupo de control23. En el mismo estudio, el 66 % de los ratones inmunizados con AgTRIO tenían parasitemia detectable en comparación con el 95 % de los ratones de control23. Si bien el adyuvante de Freund es útil para demostrar la prueba del principio, ya que es altamente inmunoestimulador y no se puede administrar a los humanos debido a sus efectos secundarios tóxicos. Con el método de ARNm de AgTRIO, el 44,4 % (4/9) de los ratones que recibieron ARNm-LNP de AgTRIO alcanzaron un nivel de parasitemia del 0,01 % después de la exposición, en comparación con el 88,8 % (8/9) del grupo de control. En nuestro estudio anterior, un anticuerpo monoclonal IgG2a AgTRIO ofreció una protección sustancial contra la infección por Plasmodium en ratones en comparación con los otros anticuerpos monoclonales de isotipo, y la protección dependía de la región Fc32. En nuestros resultados no publicados, hubo respuestas IgG1 e IgG2b específicas de AgTRIO después de la inmunización con proteína AgTRIO y adyuvante de alumbre, pero no hubo una respuesta significativa de IgG2a. AgTRIO-mRNA LNP proporciona una respuesta sólida de isotipo IgG, incluida la generación de anticuerpos IgG2a, que pueden ofrecer una protección más eficaz contra la infección por Plasmodium. Todos estos resultados demuestran que el enfoque AgTRIO mRNA-LNP puede ofrecer ventajas en comparación con las vacunas basadas en proteínas.

Además, después de una infección o vacunación, la disminución de las respuestas inmunitarias protectoras se produce con el tiempo y es la principal preocupación. A modo de ejemplo, para la mayoría de las vacunas COVID-19, la respuesta humoral disminuye más del 50% después de 6 meses34,35,36,37,38. Para mantener las respuestas humorales protectoras, se requiere una vacuna de refuerzo. Al igual que otras vacunas, las vacunas basadas en PfCSP exhiben una protección decreciente con el tiempo6,7. Si bien la respuesta humoral hacia AgTRIO disminuyó después de 6 meses de inmunización, las picaduras de mosquitos podrían aumentar los anticuerpos. Por otro lado, no hay una respuesta inmunitaria humoral significativa contra AgTRIO después de repetidas picaduras de mosquitos en humanos o ratones23, lo que indica que el efecto de refuerzo solo ocurre después de la inmunización activa con AgTRIO. No hubo efectos adversos significativos, como enrojecimiento, hinchazón o una reacción alérgica, observados durante las picaduras repetidas de mosquitos después de la inmunización con la vacuna AgTRIO mRNA-LNP en nuestro estudio. Sin embargo, es importante examinar la seguridad directamente en humanos, ya que los resultados en ratones no siempre se correlacionan directamente con los humanos. Este efecto potenciador adquirido de forma natural le da a la inmunización basada en AgTRIO una ventaja única sobre la vacuna tradicional basada en patógenos. En áreas endémicas de malaria, la exposición persistente al vector podría aumentar y mantener fácilmente los anticuerpos AgTRIO en individuos vacunados con AgTRIO mRNA-LNP. En general, nuestro estudio demuestra que una estrategia de vacuna de ARNm dirigida a una proteína de saliva de mosquito puede ayudar en el desarrollo de la próxima generación de vacunas contra la malaria y puede usarse junto con vacunas tradicionales basadas en Plasmodium.

Se criaron mosquitos A. gambiae (cepa 4arr) a 27 °C, 80 % de humedad, en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h y se mantuvieron con 10 % de sacarosa en condiciones estándar de laboratorio en el insectario de la Universidad de Yale. Se adquirieron ratones Swiss Webster y C57BL/6 de Charles River Laboratories. Todos los protocolos de experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (Número de Protocolo: 2022–07941). Todas las infecciones por Plasmodium se realizaron en instalaciones para animales con nivel de bioseguridad 2. Todos los experimentos con animales siguieron la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. En todos los experimentos, los ratones se alojaron y cuidaron en instalaciones para animales acreditadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC) en la Universidad de Yale. Para la extracción de sangre retroorbital o la alimentación de mosquitos, los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100 mg/10 mg por kg de peso corporal). Cuando terminaron todos los experimentos, los ratones fueron sacrificados usando una cámara de CO2 de una manera consistente con las pautas de AVMA para la eutanasia. Después de la muerte, los ratones se sometieron a una dislocación cervical como medio secundario para asegurar la muerte.

Se optimizó el codón de AgTRIO (AGAP001374) sin el péptido señal entre los aminoácidos 22 y 389 y luego se transcribieron ARNm de AgTRIO o luciferasa (control) para que contuvieran colas poli(A) de 101 nucleótidos de longitud. Se utilizó N-1-metilpseudouridina (m1Ψ-5′)-trifosfato en lugar de UTP para generar ARNm modificado que contenía nucleósidos. La protección de los ARNm transcritos in vitro se realizó co-transcripcionalmente usando el análogo trinucleótido cap1, CleanCap. El ARNm se purificó mediante purificación de celulosa39. Luego, el ARNm se encapsuló en LNP utilizando una solución acuosa de ARNm a pH ácido de 4,0 y se mezcló con una solución de lípidos40,41, que consistía en un lípido catiónico ionizable/fosfatidilcolina/colesterol/PEG-lípido (50:10:38,5:1,5 mol /mol) 28,29,30,31. Para la encapsulación, el ARN se mezcló con los lípidos en una proporción de ~0,05 (peso/peso). El LNP tenía un diámetro de ∼80 nm medido por dispersión de luz dinámica utilizando un instrumento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Reino Unido) y se almacena a -80 °C.

Se inmunizaron ratones hembra C57BL/6 de cinco semanas de edad con 10 µg de AgTRIO mRNA-LNP o control (Luc mRNA-LNP) y luego se les administró refuerzos con la misma cantidad de vacuna 2 y 4 semanas después. Dos semanas después de cada inmunización, se recogió el suero de cada ratón y se analizaron las respuestas de IgG usando un ELISA para confirmar los anticuerpos específicos de antígeno. Para determinar si la picadura de mosquito puede aumentar la IgG, después de que los títulos de AgTRIO IgG decayeron, dejamos que 10 mosquitos no infectados se alimentaran de los ratones. Los ratones de control no estuvieron expuestos a los mosquitos.

La carga de Plasmodium en los hígados después de la infección por esporozoitos se determinó mediante la evaluación del nivel de expresión del ARNr 18 S de P. berghei, normalizado al factor nuclear 4 alfa de hepatocitos de M. musculus, hnf4α, que se ha utilizado como gen de limpieza para el tejido hepático23,33. Estos datos se presentaron como el número de copias del gen diana por 10.000 copias del gen doméstico. Se usó el reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific) para purificar el ARN total de hígados murinos. Todas las extracciones siguieron los protocolos del fabricante. Se utilizó el kit iScript RT-qPCR (Bio-Rad) para generar ADNc a partir de ARN. Utilizando iTaq SYBR Green Supermix (Bio-Rad), se realizó una PCR en tiempo real en una plataforma en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). La PCR implicó una desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min, 50 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 60 °C y 20 s a 72 °C. Las lecturas de fluorescencia se tomaron a 72 °C después de cada ciclo. Al final de cada reacción, se verificó una curva de fusión (60–95 °C) para confirmar la identidad del producto de PCR. Los cebadores utilizados para la expresión de genes de esporozoitos se enumeran en la Tabla 1. Para evaluar la parasitemia, se recogieron 20 μl de sangre de todos los ratones mediante sangrado retroorbital. El porcentaje de parasitemia se determinó comparando los glóbulos rojos positivos para GFP con el recuento total de glóbulos rojos mediante citometría de flujo (CytoFLEX, ThermoFisher).

La secuencia genética de AgTRIO sin la región correspondiente al péptido señal ha sido clonada al vector de expresión bacteriano pET21b (GE Healthcare)23. El plásmido que expresa AgTRIO se transformará en células BL21 químicamente competentes (Thermo Fisher Scientific). La expresión de la proteína AgTRIO se inducirá con IPTG 0,1 mM a 17 °C durante 24 h. Las células se someterán a ultrasonidos en PBS con comprimidos completos de inhibidores de la proteasa libres de EDTA (Roche). El AgTRIO soluble se purificará del sobrenadante mediante una combinación de cromatografía de tamaño, intercambio iónico y afinidad. La expresión de AgTRIO recombinante se confirmará mediante inmunotransferencias, que se probarán con el suero anti-AgTRIO generado contra AgTRIO de nuestro estudio anterior23. La pureza de la proteína se determinará mediante SDS-PAGE y la concentración se determinará mediante el kit de ensayo BCA Protein (Pierce, IL).

Las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno se midieron mediante ELISA42,43. Para preparar el extracto de glándulas salivales (SGE), se recogieron 20 glándulas salivales en 100 μl de PBS y la concentración de proteína SGE fue de 0,2 mg/ml. Las microplacas de 96 pocillos se recubrieron con AgTRIO purificado (1 µg/ml) o SGE durante la noche. Después de bloquear con un tampón de bloqueo (PBS, tween-20 al 0,05 % y albúmina de suero bovino al 1 %), se diluyeron diferentes diluciones de antisueros de ratón en PBS y se añadieron a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con tampón de lavado (PBS, tween-20 al 0,1 %), se usó anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Invitrogen, Cat. No. 62–6520) con una dilución 1:10000 para detectar la IgG total. Para la detección de subclases de IgG, se utilizaron anticuerpos de cabra anti-ratón IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 conjugados con peroxidasa de rábano picante (Abcam, Cat. No. ab97240, ab97245, ab97250, ab97260) con una dilución de 1:10,000 para detectar subclase de IgG específica.

P. berghei (ANKA GFPcon, ATCC) se mantuvo mediante pases en serie en ratones hembra Swiss Webster o C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad, como se describió anteriormente23. Brevemente, ratones Swiss Webster o C57BL/6 se expusieron a glóbulos rojos infectados con P. berghei mediante inyección intraperitoneal. A continuación, los mosquitos A. gambiae se alimentaron de sangre de los ratones infectados, cuando la parasitemia era de aproximadamente el 5 %. 17 a 24 días después de la infección por P. berghei, los mosquitos se clasificaron utilizando la señal fluorescente de las glándulas salivales.

Se utilizaron datos de al menos tres réplicas biológicas para calcular las medianas con fines gráficos. Los análisis estadísticos emplearon la prueba de Mann-Whitney para grupos no relacionados y la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon unilateral para el mismo grupo con muestreo en serie para determinar si las picaduras de mosquitos aumentaron las IgG específicas de AgTRIO por ELISA. La diferencia y los datos se presentaron como mediana con rango intercuartílico (RIC). Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo. El análisis, los gráficos y las estadísticas de todos los datos se realizaron utilizando el software Prism 9.0 (Software GraphPad).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos asociados con este estudio están presentes en el documento. Las solicitudes de recursos, datos y reactivos deben dirigirse al autor correspondiente, Dr. Y.-MC ([email protected]). Todos los reactivos únicos descritos en este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente con un Acuerdo de transferencia de materiales completado.

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Damos las gracias a Kathleen DePonte y Ming-Jie Wu por su asistencia técnica. Estos estudios fueron apoyados por subvenciones AI158615, AI142708 y AI145779 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y la Iniciativa de Patógenos Emergentes del Instituto Médico Howard Hughes.

Sección de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Yu-Min Chuang, Selma Abouneameh, Hamidah Raduwan y Erol Fikrig

Instituto para la Innovación del ARN y Departamento de Medicina, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Mohamad-Gabriel Alameh y Drew Weissman

L2 Diagnostics, LLC, New Haven, CT, EE. UU.

Michel Ledizet

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Y.-MC y EF conceptualizaron y diseñaron el estudio. Y.-MC, SA y HR planificaron y realizaron inmunizaciones de animales, incluido sangrado y desafío para protección. YM.C y SA realizaron ensayos ELISA. M.-GA y DW produjeron ARNm, produjeron LNP vacío, encapsularon ARNm en LNP y realizaron la caracterización fisicoquímica de LNP. Y.-MC, ML, DW y EF escribieron el artículo con la ayuda de los coautores.

Correspondencia a Yu-Min Chuang.

EF tiene una participación accionaria y se desempeña como consultor de L2 Diagnostics. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Chuang, YM., Alameh, MG., Abouneameh, S. et al. Una vacuna de ARNm AgTRIO para mosquitos contribuye a la inmunidad contra la malaria. Vacunas npj 8, 88 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00679-x

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Recibido: 20 febrero 2023

Aceptado: 16 mayo 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00679-x

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